药物诱导肝损伤（DILI）是药物研发失败、上市后撤市的首要原因之一，传统评估模型存在显著局限：2D肝细胞单层培养缺乏生理相关性，药物代谢功能快速衰退；动物模型与人类代谢差异大，预测准确率不足60%，且难以满足高通量筛选需求。为破解这一痛点，本研究由InSphero与FDA国家毒理学研究中心（NCTR）联合开展，开发了基于384孔板的生理肝微组织高通量筛选系统——核心依赖I.DOT非接触式纳升级移液系统的精准试剂分配能力，实现152种FDA批准小分子药物的高效评估，构建出“高预测性+高通量+低消耗”的临床前肝毒性评估新方案。该系统不仅还原了体内肝脏微环境的细胞互作与代谢功能，更将药物安全性筛选的精准度与效率提升至新高度，为药物研发早期风险管控提供关键支撑[1]。
采用InSphero的3D Insight™人肝微组织（含原代肝细胞与非实质肝细胞，生理比例共培养），适配384孔Akura™球状体微孔板（优化球状体形成与营养交换），测试152种FDA批准的小分子药物（含DILI高风险、低风险及无风险药物，覆盖14个治疗领域，Figure 1）。核心检测指标为药物暴露后肝微组织的ATP含量（反映细胞活力，作为毒性终点），辅助验证肝微组织的长期功能（白蛋白分泌、CYP450酶活性）。
图1. FDA批准的152个药物组合的说明。药物与DILI关注类(DILI关注，左面板)、与肝毒性相关的警告(药物标签，中间面板)、药物标签上的DILI说明(DILI说明，右侧面板)的示意图。
药物试剂精准分配：通过I.DOT完成两大关键步骤：①将152种药物分别稀释为系列浓度（含DMSO溶剂，浓度最高兼容100%），以3~50 nL/孔的精度分配至384孔板，确保每孔药物浓度均一性（CV<5%），避免手动操作的交叉污染与体积偏差；②向每孔分配维持肝微组织功能的培养基补充液，纳升级精准控制营养供给，适配384孔板的微量反应体系（Figure 2实验流程）。I.DOT的DropDetection功能实时监测液滴释放，进一步保障分配可靠性，且PureWell设计使试剂残留<1 μL，大幅降低珍贵药物试剂的消耗。
图2. 在hLiMT中测试的药物的血药浓度和细胞毒性。A)血浆总Cmax值，b)IC50ATP值，以及c)FDA批准的152种药物的IC50ATP值与总血浆Cmax比率(C2C)与其DILI关注级别的关系。使用Dunn的多重比较检验显示了不同类别之间的统计差异以及P值。
实验流程整合：肝微组织在384孔板中预培养至功能稳定（第7天），经I.DOT分配药物后孵育后，采用CellTiter-Glo 3D试剂盒检测ATP含量，计算IC50值；通过5折交叉验证优化数据阈值（IC50/血浆峰浓度Cmax=176），区分毒性与安全药物；同步检测培养14~35天的肝微组织白蛋白分泌量与CYP1A2、CYP3A4酶活性，验证模型生理相关性（Figure 3）。
图3. C2C比率与药品标签信息的关系。A)152种FDA批准的药物的C2C比率与其肝毒性安全警示相对照，以及b)FDA批准的98种药物(“vmo-Dili-concern”和“vMost-Dili-concern”)的C2C比率与其Dili描述的对照。使用邓恩多重比较检验的组之间的统计差异以及它们的P值被表示出来。在C2C=176处画了一条虚线。
该系统对“最受关注DILI”药物的预测灵敏度达72%、特异性89%，对因肝毒性撤市的药物检测率高达80%（Figure 4）。针对神经系统靶向的肝毒性药物，灵敏度与特异性进一步提升至92%和91%，远超2D肝细胞模型（平均灵敏度<50%）与常规动物模型（预测准确率<60%）。5折交叉验证结果显示，模型稳健性良好，无明显批次效应（Figure 5），证明I.DOT保障的药物分配均一性是数据可靠性的核心前提。
图4. C2C评分与DILI关注类、解剖或药理学组的关系。A)“神经系统”解剖学组。B)“心血管系统”解剖学组。C)“消化道与代谢”解剖学组。D)“全身用抗感染药”药理组。使用邓恩多重比较检验的组之间的统计差异以及它们的P值被表示出来。在C2C=176处画了一条虚线。
图5. 实验运行和肝细胞批次的重复性。FDA批准的20种药物在3个不同的10供体肝细胞批次的hLiMT中两次测量C2C比率：批次IPHH_32(开环)、批次IPHH_24(黑色钻石)和批次IPHH_18(灰色三角形)。在批次IPHH_32中进行的初始测量被描绘为全黑圆圈。在C2C=176处画了一条虚线。
384孔板中的肝微组织可维持关键肝脏功能35天以上：白蛋白分泌量持续稳定在生理水平，CYP1A2、CYP3A4等药物代谢酶活性保持率超85%（Figure 3），显著优于2D培养（功能维持不足7天）。这一特性使其不仅适用于急性毒性筛选，还可模拟药物长期暴露的慢性肝损伤，进一步拓展了临床前评估的应用场景。
借助I.DOT的8通道协同分配能力，单块384孔板可在20秒内完成药物分配，单日可处理上千个药物浓度梯度样本，满足早期药物筛选的高通量需求。同时，纳升级试剂分配使单孔药物用量降低至纳升级，相比传统方法减少90%以上试剂消耗，大幅降低研发成本。
本研究的核心突破在于将“生理相关性”与“高通量筛选”高效结合，而I.DOT非接触式纳升级移液系统是实现这一突破的关键技术支撑——其对药物试剂（含DMSO溶剂）的纳升级精准分配，解决了384孔板微量反应体系的均一性难题，避免了交叉污染，同时降低试剂消耗；DropDetection实时质控功能则为高通量数据的可靠性提供了双重保障，完美适配临床前药物筛选的严苛需求。
与此前单细胞测序、蛋白组学相关推文不同，本研究聚焦药物研发转化场景，突出技术的实用价值：相比传统模型，该系统不仅预测准确率提升30%以上，还能兼容152种不同类型药物的筛选，覆盖多数治疗领域；384孔板与I.DOT的自动化适配，可直接整合至现有药物研发流程，缩短筛选周期3~6个月，减少晚期研发失败风险（据估算可节省数千万美元研发成本）。
应用前景方面，该系统为“替代动物实验”提供了有力工具，契合3R原则（替代、减少、优化），未来可进一步拓展至中药、生物药的肝毒性评估，或联合代谢组学、转录组学挖掘DILI分子机制。而I.DOT在药物溶剂兼容性、微量分配效率上的优势，也为其他器官微组织（如肾、心）的高通量毒理学筛选提供了可复用范式，推动临床前安全评估向“精准化、高通量化、生理化”转型。
同腾睿杰（上海）生物技术有限公司作为BICO集团 DISPENDIX I.DOT中国总代理商，为您提供优质的售前售后服务。
联系电话：021-50826962
联系邮箱：sales@ttbiotech.com
1、Fäs L, Chen M, Tong W, Wenz F, Hewitt NJ, Tu M, Sanchez K, Zapiórkowska-Blumer N, Varga H, Kaczmarska K, Colombo MV, Filippi BGH. Physiological liver microtissue 384-well microplate system for preclinical hepatotoxicity assessment of therapeutic small molecule drugs. Toxicol Sci. 2025 Jan 1;203(1):79-87.
