案例应用丨WOLF分选原代肝细胞助力倍体对增殖和类器官生长影响的相关研究

肝细胞在体内执行多种代谢和调节过程，为了了解肝脏生理和疾病发展，科学家们可以通过分离和培养原代肝细胞，形成模拟体内肝脏行为的三维类器官。然而，分离原代肝细胞是非常具有挑战性的工作。

传统的流式分选仪的分选环境对这些脆弱的细胞来说可能过于苛刻，并可能导致分选后细胞存活率大幅下降，也可能因其难以消毒的流路和工作流程而导致细胞培养污染。然而，WOLF细胞分选仪通过可抛弃式无菌微流控技术解决了这些问题，整个分选流程在低（<2 psi）压力下运行，以保持分选环境无菌和高细胞存活率。

在本文介绍的实验中，合作实验室分离了原代肝细胞，以评估倍体对增殖的影响。用WOLF和传统的分选仪分选细胞，以确定哪种仪器分选的细胞能够为未来的倍性研究提供更好的类器官形成和生长。倍性是指细胞含有的染色体组数量（N）会随着年龄的增长而增加，可以抑制体内细胞复制的速度。肝细胞倍性水平差异很大，因此确定其对增殖的影响可以改善类器官模型的分选方法，并增加对肝脏生理学的理解。

根据倍体对肝细胞进行分类：首先根据其较低的FSC和BSC，将NPCs（异质性非实质细胞）排除在肝细胞门之外（下图左）。每个Vybrant DyeCycle绿色峰表示基于DNA含量具有不同倍性的群体，根据不同的荧光强度对4N和8N峰进行分选，以评估两种倍体细胞生长和类器官形成的差异。

通过细胞成像并将8N核大小与4N核大小进行比较来验证WOLF分选的准确性。首先用DAPI对细胞进行染色，并在40倍下成像，以确定核直径和面积。分选后倍体显示，8N肝细胞核的直径和面积通常比4N肝细胞核大两倍。这证实了WOLF正确地分选和分离了4N和8N细胞。

通过BD FACSAria II分选的8N种群在第0代就显示出真菌污染，无法与WOLF进行生长比较（下图）。由于所有其他条件都是完全一致的，因此污染很可能是由BD分选仪引入的。

在传代0中，在BD FACSAria II上分选的细胞没有形成类器官，这可能是由于从恶劣的分选条件中分选的细胞受到了伤害（下图）。但在WOLF上分选的细胞长成了类器官，其形态与之前实验中分选前的肝细胞类器官相似。由于WOLF产生了预期的形态并且没有污染，因此它被用于进一步评估倍性对增殖的影响。

4N肝细胞在分选后显示出预期的“葡萄状”结构，并在第一次传代后继续增殖。8N肝细胞在分选后仍保持单细胞簇，其融合度远低于4N培养物（下图）。

与BD FACSAria II不同，WOLF分选的细胞产生了高度融合和无菌的3D类器官。使用WOLF更能够避免污染，因为它使用了可抛弃式芯片和管组，所以它的所有管路都是新的、无菌的。BD FACSAria II与大多数传统分选仪一样，使用无菌清洁但非无菌的固定管路，因此污染物可能会被引入。或者污染也可能来自露天环境，而WOLF可以装在装有HEPA过滤空气的生物安全柜中，能够避免大多环境污染。最终影响细胞存活率和类器官长成率可能是多种仪器因素：更高的分选压力（20-70psi）、通过分选喷嘴施加的剪切力以及离开系统后经历的减压冲击等，这些因素是传统流式分选仪无法避免的。而WOLF采用的低压（<2 psi）微流控分选原理能够给细胞提供更温和的分选环境，提高细胞分选的完整性和活率，而4N和8N细胞核测量也证实了WOLF流式分析的准确性。与4N细胞相比，8N细胞表现出减少的生长和3D类器官形成，表明高倍性肝细胞增殖更慢。总而言之，WOLF的无菌、高活性分选为研究肝细胞功能提供了一个新的实验平台，这些分选优势也有利于其他与肝细胞一样敏感的细胞类型的研究。