研究表明，大部份钙粘素蛋白家族与疾病，如肿瘤的发生相关。由于细胞之间的黏附需要钙粘素蛋白同源二聚化，相应的，能够调节二聚化过程的小分子，将可能成为潜在的治疗性药物。因此，本文介绍了P-钙粘素特异性小分子的鉴定，作用于P-钙粘素蛋白介导的细胞黏附过程。虽然该小分子是一种片段化的化合物，但经实验证明，它可以结合到P-钙粘素蛋白的凹陷区，此前该位点还未做为药物靶点。该分子片段能够阻止一种被称为X二聚物的中间体形成中的关键氢键的形成，进而调节了X二聚化的过程。我们的发现将对小分子用于蛋白-蛋白之间的相互作用调节以及蛋白复合物组装策略产生重要的影响。
蛋白的组装揭示了几乎所有生物学过程：1. 已有大量被报道的各种功能复合物的同源或异源结构信息；2. 能够对蛋白组装进行调节的调节分子可以做为潜在的药物或探针，用于进一步研究蛋白的功能。但小分子在调节蛋白-蛋白相互作用及组装方面存在困难，部分原因如下：首先，蛋白互作通常会牵涉到较大的分子区域，但是，小分子可以进入的区域较小。除此之外，在蛋白-蛋白互作界面，通常不存在明显的凹槽；缺少能够指导配体分子设计的天然蛋白互作分子抑制剂存在。细胞通过钙粘素蛋白家族，一类钙依赖性的细胞黏附蛋白分子，发生细胞之间的黏附，蛋白的组装。根据不同的生物组织环境，钙粘素分子在各种组织的肿瘤发生中发挥作用。P-钙粘素分子是一种经典的钙粘蛋白，已发现在许多肿瘤组织中过表达，促进了肿瘤的转移和增殖。细胞之间的聚集体形成，能够阻止anoikis和P-钙粘素蛋白介导的信号通路，这对于肿瘤细胞的存活至关重要。因此，P-钙粘素蛋白功能的抑制已成为一种潜在的抗癌策略。细胞黏附可以通过不同的细胞间的钙粘素蛋白反式同源二聚化实现，也可以通过相同细胞间的钙粘素蛋白的顺式聚集而成。对于一些类型I的经典的钙粘素蛋白，包括P-钙粘素，反式同源二聚化已经被广泛的研究。蛋白五个结构域中的两个细胞外结构域（EC12)经证实在蛋白互作的过程中发挥作用（请见Fig. 1a)。X二聚物，也被称为链-插入二聚物（S-S dimer)，是一种中间过渡状态，能够促进最终二聚体的形成。S-S二聚物具有一种特定的结合模式，在该结合模式之下，一个单体N末端的色氨酸残基可以插入另一个单体的疏水口袋。根据这种模式设计的一些肽类分子模拟配体已有相关报道，但还未有相关的配体分子被鉴定，可能是由于这个疏水口袋在S-S二聚化状态期间，一直被单体自身或另一个单体的色氨酸残基所占据，进而影响了对相关分子机制的更进一步深入研究。在体外进行S-S二聚化过程的抑制研究也许不是最好的方法，我们需要考虑其他方式，研究小分子在调节细胞黏附分子组装方面的功能。
本研究中，我们对这个过程下的任何状态进行了小分子筛选，该筛选文库包括类似药物的小分片段，鉴定出了一种全新的可以特异性与P-钙粘素蛋白结合的小分子。该化合物分子能够通过调节X二聚化抑制细胞之间的黏附，间接的抑制了能够稳定X二聚物的疏水键的形成。
该化合物文库包含1973种化合物。做为初步的筛选，进行了分子之间相互作用检测。P-钙粘素蛋白的单体突变蛋白称为REC12，其中精氨酸被插入到EC12的氨基端，通过生物素-链霉亲和素捕获法，被固定在生物传感器芯片表面，含有100uM化合物的溶液流经生物芯片表面。根据固定的分子水平，REC和化合物的分子量，推测结合应答的RMAX在20RU左右。在1973种化合物文库中。144种化合物的结合应答效率超过10RU。
作为更进一步的筛选过程，我们将一种称为EC12的蛋白结构状态固定在CM5传感器芯片表面。这种结构是位于单体和S-S二聚体之间的一种平衡态。我们进行了一种称为ABA的检测实验，即A和B两种溶液都流经芯片表面。2uM的EC12被称为溶液A，含有上述第一轮筛选后的化合物的溶液为溶液B，浓度为100uM.对于A溶液，单体结合应答以及单体和芯片之间的共价结合应答，都被检测到；对于B溶液，两种化合物明显的抑制了结合应答效率（请见Fig. 1C）。这些化合物破坏了二聚化的形成，使得单体不能共价结合到芯片表面。但只有其中一种化合物，Hit 1, 显示出了剂量依赖性结合应答。单体突变的KD值约为916uM(请见Fig. 1e）。
Fig. 1 SPR对潜在化合物筛选示意图
我们进行了X-射线晶体衍射实验，用以鉴定Hit 1与单体，REC12的结合位点，阐明Hit 1的抑制效应。REC12经结晶后，与终浓度10mM的Hit 1进行结合，该复合物经衍射后分辨率为2.30 Å （请见Fig. 2a, Table 1）。位于EC1和EC2之间的结构域的浅腔内，观察到了可以用于建模的Hit 1的电子密度分布。Hit 1一经与REC12结合，相对于未结合Hit 1的REC12，其Y140侧链发生了偏转（请见Fig. 2b），Y140和Hit 1形成了一个CH–π的相互作用。这里需要注意，无论是结合Hit 1还是未结合Hit 1的REC12结构，都是高度的同型的，因此差异不应来自高度同型的Hit 1时，会有一个水分子位于REC12晶体结构的腔内。因此，与Hit 1结合的启动效应有可能来自于和Y140残基的互作以及脱水作用。同时发现，Hit 1和R68, V98, T99, D100和D137存在范德华力引起的相互作用（请见Fig. 2C）。为了更进一步确认在Hit 1结合后的晶体结构中观察到的电子密度，我们通过SPR相关技术，检测了REC12 Y140R和Hit 1的结合效应，发现Hit 1未能够和该突变结合，证实了Y140位点在相互作用中的作用。在结合口袋周围的数个氨基酸残基，比如Y140,D100和Q101经报道对于X二聚化至关重要。在X二聚体中，可观测到Y140和K14，Q101和D100之间存在氢键。尽管Hit 1未能直接破坏这些氨基酸残基之间的氢键，但是该区域结构的改变显著抑制了X的二聚化。
有趣的是，当我们将P-钙粘素-Hit 1复合物结构与E-钙粘素结构进行叠加时，我们发现E-钙粘素的腔室体积小于P-钙粘素的腔室体积。通过CASTp 30对P-钙粘素，E-钙粘素结构和P-钙粘素单体-Hit 1复合物结构的腔室体积进行测量，也证明了这一点，分别是12.2 Å 3 , 5.4 Å 3 , 21.4 Å 3。该结果表明较之于E-钙粘素，P-钙粘素的腔室更适合于结合Hit 1分子。此外，FTPap分析得到的31个结合区域，都存在于P-钙粘素中。SPR数据同样表明，Hit 1不与E-钙粘素结合，但是能够与E-钙粘素N140Y突变体结合（请见Fig. 2e）。因此，与Hit 1的结合腔室，能够做为P-钙粘素选择性配体设计的起始点。
Fig. 2 Hit 1与P-钙粘素蛋白结合位点鉴定
为了检测Hit 1对X二聚化的影响，本文利用了氢-氘交换质谱分析法（HDX-MS）。该方法能够检测在Hit 1存在与否的情况下，X二聚物的互作面有多大程度暴露在溶剂中。在采用 LC-MS 进行检测之前先进行胃蛋白酶处理，从而能够从 P-钙黏蛋白分子的几乎所有区域分离出肽片段。在Hit 1存在与否的情况下，检测每一段肽段的HDX比率（氢氘交换比率）。在相互作用界面之一（残基134-140和137-147）的相应区域，该区域由于在EC12的N端插入了甲硫氨酸，能够形成X二聚物，但不能形成S-S二聚物，因此抑制了strand-swapping，Hit 1存在时的氢氘交换比率高于未结合Hit 1时（请见Fig. 3a)。该结果表明，Hit 1对X二聚物的互作界面能够产生影响。
为了进一步研究Hit 1如何影响X二聚化，X二聚物（MEC12）经结晶后，与终浓度10mM的Hit 1进行结合，形成的复合物结构的分辨率为2.45 Å（请见Fig. 3b）。与上述发现Hit 1的过程中相同，能够检测到三个独立的电子密度分布，其中的两个位于Y140残基周围的腔室，如Fig. 2a中所示。另一个位于EC2结构域的交汇处（请见Fig. 3b）。位于腔内的这些 Hit 1 分子与 Y140 形成了π-π相互作用，并与口袋周围的残基或水分子形成了氢键连接。由于Hit 1分子能够与X二聚物的腔室结合，与口袋周围的残基形成多种非共价相互作用，Hit 1和X二聚物结合的亲和性似乎更高。该推测经switchSENSE技术进行了确认。Hit 1分子与EC2结构域交汇处的互作主要产生于范德华力。X二聚化中的Y140周围的腔室结构与单体的不同，Hit 1的结合模式较单体也有可能存在差异。
与X二聚物无辅因子的状态相比，与Hit 1结合的X二聚物呈现出较显著的结构变化。EC1-EC2结构域角度变得平滑，B链相对于A链发生了转变（请见Fig. 3c）。该角度的结构变化推测可能是由于两个Hit 1分子结合在Y140周围的腔室引起。在 X 多聚体的界面处，K14 的侧链与 A138 的主链之间形成的氢键（即在 Hit 1 结合时形成的那一个）被破坏了（请见Fig. 3d），可能导致了两个单体分子的位置转变。
为了进一步确认K14侧链和A138 的主链之间形成的氢键对X二聚化形成的重要性，本文使用了尺寸排阻色谱 - 多角度光散射，分别测量了X二聚物（MEC12）和X二聚物突变体K14A的分子量。得到的分子量大小分别是X二聚物为33.8kDa, X二聚物K14A突变体为24.2kDa。
由于在Hit 1结合的X二聚物中，K14和侧链A138之间的关键互作被破坏，我们推测X二聚物的结构可能代表着X二聚化形成过程中的一种不稳定状态。为了检测无辅因子存在时的X二聚物的不稳状态或溶液状态下的动力学，我们进行了分子动力学的模拟。进行了三次各持续 100 纳秒的独立模拟，并通过 Cα 原子的均方根偏差（RMSD）来确认轨迹的收敛性。由此我们计分别计算出了K14A-A138之间我们分别计算的供体氢键和受体氧分子之间的距离（请见Fig. 3f），数据表明在频率分布上存在两个峰，一个是 2.6 Å，另一个是4.8 Å。这种非对称特性在所有的轨迹中被检测到。在Hit 1分子结合下的蛋白晶体结构中，距离则分别为 4.6 和2.6 Å。上述结果表明，在氢键形成时，无辅因子状态下的X二聚物动力学可能存在两种状态，与Hit 1结合状态下的X二聚物的两种晶体动力学状态一致。换句话说，apo状态的 X 大分子能够呈现出与在晶体结构中与 Hit 1 结合的 X 大分子所呈现的构象非常接近的构象，即便没有 Hit 1 化合物的存在也是如此。表明，在晶体结构中观测到的Hit 1结合下的X二聚物的状态是X二聚化过程中的一种状态。总的说来，Hit 1的结合可能会通过将X二聚物限定在二聚化过程的一种状态下，进而干扰对X二聚化非常重要的氢键的形成。和orthosteric抑制剂不同，Hit 1不会直接的阻止两个单体之间氢键的形成，而是可能通过改变单体结构，进而阻止氢键的形成。
Fig. 3 Hit 1对蛋白二聚化的影响鉴定
我们进一步通过细胞-聚集检测技术，验证了Hit 1是否能够抑制细胞之间的黏附作用。我们通过Flp-In-CHO体系，构建了一种表达P-钙粘素的CHO细胞系。在该检测中，除了P-钙粘素蛋白，细胞外蛋白经胰蛋白酶消化，使得细胞之间的黏附和细胞聚集体的形成仅仅取决于P钙粘素分子的相互作用。实验表明，空白对照组CHO细胞之间未能够形成大的细胞聚集体（请见Fig. 4a，c）。在胰蛋白酶消化后，培养基替换成不含钙离子的培养基，以防止细胞聚集，通过添加1mM的CaCl2促进细胞聚集。在细胞发生聚集反应后，使用微流控成像(MFI)设备测量细胞聚集体尺寸大小分布。在MFI的测量中，大于40um的细胞聚集体被定义为P-钙粘素依赖的细胞聚集，因为在EDTA存在时，会有大量的大小在25-40um的细胞聚集体存在。为了对数量进行标准化，通过计算大于40um-100um的颗粒数与大于25-100um的颗粒数的比值实现。在对照实验中，EDTA能够抑制大的聚集体（40-100um)的形成，因此细胞黏附取决于钙依赖性的P-钙粘素分子的相互作用（请见Fig. 4a，c)。
当同时添加Hit 1和1mM的CaCl 2分子时，聚集体的形成呈现Hit 1浓度依赖的方式（请见Fig. 4b, c)。而当Hit 1加入到已经形成聚集体的培养体系中时，在检测时间段，形成的聚集体仍旧稳定存在，而EDTA能够部分的破坏已经形成的聚集体。这些结果说明，Hit 1是通过阻止X二聚化形成过程中两个单体分子的互作，一旦细胞聚集体形成，Hit 1是无法破坏它们的互作稳定性的。
为了对Hit 1在X二聚化过程中的效应进行量化分析，我们进行了脂质体聚集检测。我们首先制备了带有 C 端组氨酸标签的 X 二聚体（MEC12），然后将该蛋白质与一种基于 DOPC 的脂质体一起孵育，该脂质体中含有 10% 的具有镍吸附作用的脂质 DOGs-NTA-Ni，并在 EDTA 存在下使 P-钙黏蛋白分子失活。在这些条件之下，在650nm的吸收光下，未观测到聚集（请见Fig. 4d）。我们也同时观测到，脂质的聚集仅仅在MEC12和 CaCl 2都存在时发生（请见Fig. 4d）。一旦CaCl 2添加到溶液中，脂质体聚集，推测是通过被捕获在脂质体表面的C端带有组氨酸标签的X二聚物（MEC12）的二聚化引起，可通过逐渐增加的650nm处的吸光值检测，该吸光值最后可达到平台期（请见Fig. 4d）。通过使用一相结合的指数衰减方程模型，计算出了脂质体聚集的观测速率常数（kobs），以此作为 X 双聚体化动力学的指标。Hit 1存在时的速率常数(k obs = 0.0033) 显著低于Hit 1未存在时的速率常数 (k obs = 0.0086)（请见Fig. 4e）。此处需注意，这并非是由于钙粘分子的激活引起，因为通过DSC测量可知，无论Hit 1存在与否，钙离子与钙粘素分子的结合并未被Hit 1所抑制。该结果表明，Hit 1通过间接的破坏对X二聚化形成关键的氢键，抑制了X二聚化的过程，进而抑制了细胞的聚集。
我们利用两种细胞系分析了Hit 1对于内源性P-钙粘素分子介导的细胞黏附的效应，以及对于不表达P-钙粘素分子的细胞聚集效应。其中HCT116表达内源性P-钙粘素分子，MCF7细胞不表达P-钙粘素分子。将细胞种植在培养板中，并添加100uM的Hit 1分子，细胞聚集程度通过对整体区域面积下的聚集体进行定量分析。由于HCT116和MCF7的每一个单细胞区域都不同，标准化后的细胞区域经Hit 1存在时，每一个浓度下的整体细胞区域比上Hit 1不存在时整体细胞区域计算得到。在100uM的Hit 1存在时，HCT116细胞标准化后的细胞区域，下降到未加入Hit 1时的细胞区域的75.7%，但Hit 1对MCF7细胞标准化后的区域没有产生影响（请见Fig. 4f）。已有研究报道，P-钙粘素蛋白敲除后对肿瘤转移具有一定的影响，以及对细胞内信号通路的影响。本研究中结合已有的表型研究表明，在表达P-钙粘素分子的肿瘤细胞中，Hit 1能够抑制细胞之间的黏附作用，进而导致β -catenin信号通路的下调及细胞凋亡信号的激活。
Fig. 4 Hit 1抑制细胞黏附检测
由于Hit 1以及初筛鉴定的许多化合物都包括阳离子功能基团，我们因此通过基于吲哚的商业化合物：tryptamine, tryptophan, 和 auxin 鉴定了阳离子功能基团对于结合活性的重要性（请见Fig. 5a）。令人惊讶的是，只有tryptophan与 P-钙黏蛋白结合，这可能是由于Hit 1结合口袋周围蛋白表面存在着负电荷。该结果表明，在进一步的药物发现中，不应对阳离子基团进行修饰改造。根据Hit 1和P-钙粘素蛋白的2D相互作用图谱的研究（请见Fig. 2c），我们制定了两个进一步合成的策略：（1）将吲哚环第二个位置的甲基替换成羧基，这将导致羧基和R68，氨基和D137之间形成盐桥；（2）将吲哚环中 C5 位置的氯原子替换为一种更大分子量的官能团，抑制第二个单体的接近。我们首先合成了3-(2-氨基乙基)-5-苯基-1H-吲哚-2-羧酸（简称 Hit 1-羧酸，请见Fig. 5b），但是从SPR亲和性检测来看，它与REC12的亲和性并不优于Hit 1，也不具备细胞聚集抑制效应。接下来，我们合成了 2-(2-甲基-5-苯基-1H-吲哚-3-基)乙烷-1-胺（苯基-Hit 1）（请见Fig. 5b)。通过SPR互作检测分析，我们观测到一种剂量依赖性应答；其与REC结合的亲和性与Hit 1相同。在脂质体聚集检测中，苯基-Hit 1相比较于Hit 1,具有更强的抑制活性。tryptamine, auxin 和 tryptophan对聚集效应影响较小（请见Fig. 5c）。Tryptamine 不具有大的功能基团，这可能是它不能抑制脂质体聚集的原因。在细胞聚集检测中，苯基-Hit 1相较于Hit 1具有更强的抑制效应，且苯基-Hit 1与X二聚体的结合亲和性要强于单体P-钙粘素蛋白。
Fig. 5 抑制剂设计策略
