用蛋白质翻译系统是生命的核心“蛋白工厂”。从无到有重构能够自我再生的翻译机器，是构建人工最小细胞、解析生命起源的关键关卡。魏茨曼科学研究所 Roy H. Bar-Ziv 团队利用I.DOT非接触式纳升级移液系统，结合DNA Brush（DNA刷）表面局域化表达技术，成功实现除核糖体之外全部30种翻译辅助蛋白的同步自主合成，向着自维持人工细胞迈出重要一步。
PURE系统是一套体外重构的大肠杆菌无细胞蛋白翻译体系，包含核糖体、20种氨酰tRNA合成酶（aaRS）、起始/延伸/释放因子共三十余种蛋白，能够在试管内完成转录翻译全过程。
核心悖论：翻译机器本身全部由蛋白质构成，合成这些蛋白又必须依赖翻译机器，形成闭环。想要实现自我再生，体系需要在极低初始蛋白浓度下“启动”，也就是自举（boot-strap）。
过往研究仅实现少数翻译蛋白的自我合成；如果在溶液体系同时表达全部30种蛋白，产物浓度过低，无法检测到活性，成为巨大瓶颈。
在整套实验中，德国Dispendix I.DOT非接触式纳升级移液系统承担了关键的微量种子蛋白梯度分液工作。 在ΔPi-PURE缺失恢复实验中，需要对每一种翻译蛋白，设置几十组梯度的“种子蛋白”浓度，找到能够触发自我合成的临界启动浓度。很多蛋白种子仅为亚纳摩尔级别，传统移液很难精准完成微量稀释与复孔分装。
I.DOT凭借nL级非接触分液能力，无需吸头，无交叉污染，低死体积，把不同稀释度的种子蛋白自动分配到384孔板，完成大批量ΔPi-PURE缺失恢复实验，帮助科研人员逐个测定30种翻译蛋白各自的最小启动种子浓度，为后续DNA刷芯片实验奠定定量基础。
策略一：
溶液体系——ΔPURE缺失-恢复实验
研究人员逐个敲除PURE系统中的目标蛋白，构建ΔPi-PURE缺失体系；向缺失体系中加入该蛋白对应的基因，观察报告基因GFP荧光是否恢复。
-
20个氨酰tRNA合成酶（aaRS）：10种不需要外源种子即可恢复；另外10种必须加入极低浓度纯化蛋白作为“种子”才能启动自我合成。基因越长，越难无种子恢复。
-
延伸因子EF-Ts、EF-G可以顺利恢复；EF-Tu需求浓度极高，单步溶液反应很难观察恢复活性，需要两步接力实验证明新生蛋白具备功能。
-
起始因子、释放因子：单基因敲除瓶颈不明显，需要多基因组合敲除制造翻译瓶颈，验证全部7个蛋白的自合成活性。
图1、aaRS的缺失恢复实验与DNA刷芯片TIRF成像。d展示ValRS种子梯度下GFP荧光动力学曲线；f-h为硅芯片上DNA刷的全内反射荧光显微镜成像，DNA刷编码20个aaRS，表面抗体捕获新生GFP-HA，直观看到随aaRS基因占比升高，报告蛋白产量上升。
策略二：
DNA刷表面局域化，突破溶液浓度限制
即便已经得到每种蛋白的临界种子浓度，游离溶液中同时表达全部30种蛋白，仍然没有可检测信号。 团队把编码全部30个翻译蛋白的DNA固定在硅片表面，构建高密度DNA刷（DNA Brush）反应中心：
-
DNA被高密度锚定在芯片表面，招募PURE翻译机器在局部工作；
-
mRNA、新生蛋白被局限在DNA刷附近，局部浓度被显著抬升；
-
芯片表面修饰抗HA抗体，可以捕获带HA标签的GFP报告蛋白，使用TIRF显微镜高灵敏度读取信号。
当DNA刷包含全部30种翻译蛋白基因，在经过I.DOT非接触式纳升级移液系统定量预实验确定的种子条件下，芯片表面出现显著GFP荧光；如果DNA刷不含翻译蛋白基因，则几乎没有信号。证明：这30种翻译蛋白可以在同一个反应中同步被合成，并且具备翻译活性。
图2、全部30种翻译蛋白在DNA刷芯片上的自主生物发生。c是时间序列TIRF图片，对比0%和90%翻译蛋白基因的DNA刷；d-e的荧光曲线证明，只有完整的一套翻译蛋白基因存在，才能够驱动报告蛋白大量合成，实现翻译机器的自我再生。
1.在体外PURE无细胞系统，除核糖体之外的全部30个大肠杆菌翻译辅助蛋白，可实现自主同步生物发生；
2.游离溶液中多蛋白共合成存在浓度壁垒，DNA刷表面局域化是实现多组分同步自再生的关键手段；
3.每种翻译蛋白都存在专属最小“种子”启动浓度，I.DOT非接触式纳升级移液系统助力高通量定量测定该临界参数；
4.本工作距离完整自再生翻译系统只差核糖体，为构建完全自再生人工最小细胞开辟完整实验范式。
同腾睿杰（上海）生物科技有限公司作为CYTENA DISPENDIX I.DOT中国总代理商，为您提供优质的售前售后服务。
联系电话：021-50826962
联系邮箱：sales@ttbiotech.com
SchwarzSchilling M, et al. Autonomous biogenesis of the entire protein translation machinery excluding ribosomes. bioRxiv, 2024. doi:10.1101/2024.10.20.619270
