SPARK-seq如何借助heliXcyto筛出“慢解离”适配体

研究团队先以SUM159PT细胞为靶细胞、MCF-10A为反筛细胞，使用未修饰单链DNA文库完成4轮Cell-SELEX；随后针对候选膜蛋白进行多重CRISPR扰动。在同一细胞中，平台同步读取mRNA、gRNA身份和适配体UMI：若某一蛋白被敲除后，特定适配体的结合量明显下降，即可建立该序列与靶点之间的候选关系。经过质量控制，主体分析纳入8466个具有明确gRNA身份的单细胞。

对丰度最高的10000条序列聚类后，研究获得1906个家族，并最终将5535条适配体映射至PTK7、CDCP1、NRP1、NRP2、ITGA3、PTPRD、PTPRF和PTPRS等8种膜蛋白，覆盖超过两个数量级的靶点丰度。SPARTA计算框架进一步用于序列分类和变体生成；在PTK7概念验证中，15条生成候选有12条能够结合PTK7，其中SPARK-Apt-18表现出最慢的解离。

终点结合信号不能区分一条适配体究竟是结合更快，还是解离更慢；即使K_D相近，k_on和k_off也可能完全不同。为解释富集规律，作者使用heliX^cyto®系统开展实时相互作用细胞分析（scIC）。SUM159PT或A549细胞被导入尺寸为15–25 μm的微流控细胞陷阱，在无需固定细胞或纯化膜蛋白的情况下，实时记录单细胞荧光变化。

检测在25 °C进行，使用10 nM FAM标记适配体：结合阶段420 s，流速25 μL·min^-1；解离阶段1200 s，流速50 μL·min^-1。数据经无细胞陷阱和缓冲液基线双参比校正，并采用1:1 Langmuir模型全局拟合，获得k_on、k_off和K_D。其中k_off越小，说明复合物解离越慢、靶点驻留时间通常越长。与纯化蛋白SPR互补，heliX^cyto提供了完整活细胞膜环境中的原位动力学信息。

图1、SPARK-seq总体流程：通过CRISPR扰动、单细胞gRNA/mRNA/适配体联合测序完成适配体—靶点映射，并以SPARTA开展结合预测与变体生成。

SPARK-seq一次性将5535条适配体序列对应到8种经验证的膜蛋白，并把序列富集、基因扰动响应与靶点归属联系起来。NRP1与NRP2适配体未显示可检测的交叉反应；Apt^PTPRD/F/S-4-5则可同时结合PTPRD、PTPRF和PTPRS，提示其可能识别保守表位。遗传扰动还有助于排除共同被pull-down的伴随蛋白。需要明确的是，这些大规模映射由SPARK-seq完成，heliX^cyto承担代表性候选的活细胞动力学验证。

−log₂(FC)表示靶基因敲除后适配体结合下降的幅度，数值越高，结合损失越明显。PTK7适配体的流式k_off与该指标强相关（R²=0.84，P<0.0001），而K_D几乎无相关性（R²=0.0001，P=0.96）；在SPR中，k_off仍保持最强相关（R²=0.88，P<0.0001）。这说明平衡亲和力或序列丰度不能独立代表最佳动力学。针对PTK7、NRP1和NRP2，按SPARK-seq高−log₂(FC)优选的候选，其流式解离速率约比传统按最高序列丰度选出的候选慢10倍。

在heliX^cyto活细胞scIC检测中，k_off与−log₂(FC)显著相关（R²=0.8725，P=0.0007）；K_D和k_on的相关性则较弱且不显著。这表明在完整活细胞膜环境中，解离速率仍是解释SPARK-seq富集差异最有力的动力学参数。补充图S10B展示了PTK7、CDCP1、NRP1、NRP2、ITGA3及PTPRD/F/S适配体在10 nM条件下的代表性实时曲线，图中拟合K_D覆盖0.33–29.00 nM。除NRP2适配体在A549细胞检测外，其余均使用SUM159PT细胞。流式、SPR与heliX^cyto从群体细胞、纯化蛋白和活细胞原位三个层面，共同支持慢解离序列被优先富集。

图2 上：6条代表性适配体在10 nM条件下的活细胞scIC实时曲线（补充图S10B；NRP2适配体使用A549细胞，其余使用SUM159PT细胞）。下：PTK7适配体的koff与−log2(FC)显著相关（R2=0.8725，P=0.0007；每个克隆n=3次生物学重复，均值±SD；主文图6F）。