PET报告系统实现低背景高灵敏追踪，heliXcyto验证活细胞表面皮摩尔级结合

研究团队构建了由257个氨基酸组成的跨膜报告蛋白DTPA-R，其胞外结构域可特异识别DTPA-镧系金属复合物；配套探针[¹⁸F]F-DTPA分子量小、清除快，可在报告蛋白阳性细胞表面富集。研究首先在工程化Jurkat细胞中验证DTPA-R表达及探针结合，再将该系统导入抗CD19 CAR T细胞和AAV载体。

整个验证链条包括：细胞表面表达与可及性分析、heliX^cyto活细胞动力学测定、SPR及竞争结合交叉验证，以及小鼠PET成像、流式细胞术和组织学对照。这样的设计既回答了“是否特异结合”，也进一步回答了“结合有多快、解离有多慢，以及体内信号能否反映细胞数量”。

在 RT-IC 实验中，研究人员将表达 DTPA-R 的活 Jurkat 细胞配制为3×10⁶ cells·mL⁻¹，并向 heliX^cyto M5 芯片进样 35 μL；芯片包含五个流通式细胞捕获区及空白参考区。两种 Alexa Fluor 647 标记的 DTPA·Tb 类似物分别以 0.2、1 和 5 nM 依次进样；每个浓度结合 5 min（25 μL·min⁻¹），随后解离 40–60 min（50 μL·min⁻¹）。样品盘保持 15 °C，测量温度为 25 °C。

传感曲线采用全局单指数1:1模型拟合，并允许不同循环使用独立响应幅度，获得结合速率k_on、解离速率k_off和亲和力K_D。heliX^cyto在这里并不负责PET成像，而是直接在完整活细胞表面定量“探针—报告蛋白”相互作用，帮助确认成像探针具备快速结合、较慢解离和亚纳摩尔亲和力。

图1、活细胞 RT-IC 动力学及 SPR 互补验证。d–h：peptide 配体的 5 次 RT-IC 实验；i–k：thiourea 配体的 3 次 RT-IC 实验，均依次使用 0.2、1 和 5 nM 配体。l：128 nM eGFP 偶联配体的 SPR 实验，并非 heliXcyto 数据。RT-IC 横轴为 min、纵轴为 kcps（千次计数/秒）；

thiourea 配体的 K_D 为（421 ± 34.2）pM，kon 为（1.45 ± 0.116）× 106 M⁻¹·s⁻¹，k_off 为（6.05 × 10⁻⁴ ± 7.72 × 10⁻⁶）s⁻¹；peptide 配体的 K_D 为（507 ± 143）pM，k_on 为（1.04 ± 0.265）× 10⁶ M⁻¹·s⁻¹，k_off 为（4.97 ± 0.919）× 10⁻⁴ s⁻¹。数据据 Supplementary Table 3。按 t_1/2 = ln 2 / k_off 由平均 k_off 计算，两者体外复合物解离半衰期约为 19.1 和 23.2 min。跨方法所得 K_D 或 IC₅₀ 大致处于 200–600 pM 范围，均支持高亲和力结合；但 IC₅₀ 是竞争实验指标，不能直接等同于 K_D。

[¹⁸F]F-DTPA在DTPA-R阳性细胞上的结合信号较对照细胞提高约1,000倍；Accutase切割实验显示，约88%–89.4%的细胞结合放射性位于可接近的细胞表面。高亲和力、表面可及性以及小分子探针的快速体内清除共同提高了靶/背景对比度，使报告细胞能够在较低非特异背景下被识别。

在系统性Raji肿瘤模型中，研究者连续30天观察到DTPA-R CAR T细胞向骨髓和病灶区域的归巢与扩增；PET信号与骨髓中流式计数得到的CAR T细胞数量高度相关（R² = 0.92）。作者估算骨病灶中约1,200个CAR T细胞即可形成可检出信号；体外模型约500个细胞、低灌注皮下模型约8,000个细胞可被检测。该平台还用于呈现AAV9剂量依赖的器官转导，说明同一报告体系可覆盖细胞治疗与病毒载体两类应用。

图2、从分子动力学到体内追踪的多层验证。A，不同方法得到的k_on-k_off分布；B，DTPA-R CAR T细胞在治疗过程中的纵向PET成像；C，PET信号与骨髓CAR T细胞计数的相关性；D，低细胞数病灶的代表性PET-MR图像。