抗体亲和力成熟通常先在纯化蛋白层面获得结果，但候选分子进入真实细胞表面环境后，是否仍能保持预期的结合与解离行为，决定了这些优化能否真正转化为更有价值的候选分子。Harwardt 等构建了一种在同一 Fab 中同时识别 EGFR 与 PD-L1 的 Two-in-One 抗体 HCP-LCE，并通过轻链 CDR3 单氨基酸替换获得亲和成熟变体 LCE-E。BLI 结果显示，LCE-E 对 EGFR 的亲和力提高约 60 倍，同时保留对 PD-L1 的结合能力。为了进一步回答“纯化蛋白上的提升能否在细胞上兑现”，研究者使用 heliXcyto原生分子互作细胞分析系统，在 EGFR/PD-L1双阳性肿瘤细胞上实时观察抗体的结合与解离过程 [1]。
研究比较亲本抗体 HCP-LCE 与亲和成熟变体 LCE-E。两者均可同时识别 EGFR 和 PD-L1，其中 LCE-E 在轻链 CDR3 第 3 位由酪氨酸替换为谷氨酸。细胞层面选择 A431 与 A549 两种 EGFR/PD-L1 双阳性肿瘤细胞：A431 的两种靶点表达水平整体高于 A549，而两种细胞中 EGFR 表达均高于 PD-L1，可用于观察靶点密度不同背景下的实时结合行为。
验证链条分为三个层级：BLI 用于确认纯化蛋白层面的亲和力提升；heliX+ 通过 switchSENSE 在单蛋白及 EGFR/PD-L1 双蛋白表面提供正交动力学验证；heliXcyto则进一步把测量推进到完整细胞表面，直接比较两种抗体在原生靶点环境中的结合、解离与驻留时间。
研究采用heliXcytoM5 芯片，将细胞捕获于芯片上 5 个独立的细胞捕获网中。除一次 A431-LCE-E 测量外，其余实验细胞均经 2% PFA 固定 15 分钟；细胞以 2 × 10^6 cells/mL 的浓度上样。HCP-LCE 与 LCE-E 分别使用红色荧光染料标记，并以逐步升高的浓度连续进样。抗体结合时荧光信号上升，切换至缓冲液后信号下降，从而在同一条曲线上连续记录结合与解离。
每个结合步骤记录 300 s，随后以缓冲液记录 1800 s 解离过程。研究使用单相结合、双相解离模型对曲线进行拟合，获得结合速率、两组解离速率及半衰期等参数。相比只提供终点强度或 EC50 的细胞检测，heliXcyto 可以区分“结合得更快”与“解离得更慢”，并直接显示候选抗体在细胞表面的保留时间。
图1. EGFR/PD-L1 双阳性 A431 与 A549 细胞上的实时结合动力学。HCP-LCE（A、B）和 LCE-E（C、D）通过 heliXcyto RT-IC 测量；细胞固定后加载至 5 个独立细胞捕获网，荧光标记抗体以递增浓度连续进样，随后切换缓冲液监测解离。曲线采用单相结合、双相解离模型拟合。
BLI 测量显示，LCE-E 与另一亲和成熟变体 LCE-D 对 EGFR 的亲和力较亲本 HCP-LCE 提高约 60 倍，KD 进入个位数纳摩尔范围；提升主要来自解离速率的改善，而对 PD-L1 的结合动力学基本保持一致。heliX+ 的 switchSENSE 结果进一步显示，LCE-E 与 EGFR 的结合更稳定，并可在同一双蛋白表面分别读取 EGFR 与 PD-L1 的实时结合行为。这里的 60 倍提升来自纯化蛋白 BLI，而不是heliXcyto 的直接测量。
在 A431 和 A549 细胞上，HCP-LCE 与 LCE-E 均呈现清晰的浓度依赖性结合信号，并在切换缓冲液后进入可连续追踪的解离阶段。多数相互作用表现为双相解离，说明细胞表面多靶点、多价态及靶点密度共同塑造了比纯化蛋白体系更复杂的动力学行为。heliXcyto 将这类异质性保留在可拟合的实时曲线中，为候选分子比较提供了比单一终点信号更完整的信息。
在 A431 与 A549 两种细胞系中，LCE-E 均表现出更慢的第二解离速率（kd2）。基于拟合模型计算的半衰期结果表明，亲和成熟后的抗体可在细胞表面保留更长时间。值得注意的是，A431 上亲本 HCP-LCE 的部分 KD2 数值较低与其更快的结合速率有关，因此评价候选分子不能只看一个 KD；同时观察 kon、koff、相位贡献和半衰期，才能更准确地区分亲和力改善背后的真实动力学来源。
图2. heliXcyto 结合曲线经单相结合、双相解离及完全解离模型拟合后的动力学参数。（A、B）结合速率与两组解离速率的 on-off rate map；（C）快速与慢速解离阶段对总解离振幅的相对贡献；（D）各相互作用的计算半衰期。
这项研究展示了一条从纯化蛋白到原生细胞表面的完整验证路径：BLI 给出亲和力提升的定量结果，heliX+ 在可控的单蛋白/双蛋白表面拆解结合行为，heliXcyto 则在完整细胞表面检验这些优化是否仍然成立。对于 LCE-E，细胞层面的关键证据不是简单复制一个 KD 数值，而是观察到更慢的解离与更长的表面驻留时间，从而把“亲和力提高”转化为更贴近细胞环境的动力学证据。
对抗体发现与工程团队而言，heliXcyto 的价值在于直接利用靶阳性细胞进行实时动力学比较，减少仅凭终点流式强度或纯化蛋白数据筛选候选分子的盲区。它尤其适合评估多靶点、多价结合及不同靶点密度下的候选抗体行为，为先导分子排序和机制判断提供补充依据。需要注意的是，本研究主要使用固定细胞，且更高亲和力或更长驻留时间并不等同于更好的临床疗效，仍需结合功能、药代与体内研究综合判断。
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参考文献
[1] Harwardt J, Geyer FK, Schoenfeld K, Baumstark D, Molkenthin V, Kolmar H. Balancing the Affinity and Tumor Cell Binding of a Two-in-One Antibody Simultaneously Targeting EGFR and PD-L1. Antibodies. 2024;13(2):36. doi:10.3390/antib13020036.
