细胞周期用于描述细胞在细胞分裂过程中经历的各个阶段，共分为三个独立的阶段，细胞周期的一个关键指标是倍性，即基因组的倍数。哺乳动物细胞为二倍体（2N），拥有来自母体和父体的基因组拷贝。第一阶段（G1期）为2N，细胞在此阶段生长以准备进行DNA复制。第二阶段是合成期（S期），在此阶段DNA被复制为4份拷贝（4N），以准备细胞分裂。在最后一个阶段，细胞会合成蛋白质和细胞器以支持两个2N的子细胞，随后发生有丝分裂（M）。此外还有一个额外的2N阶段，即G0期，此时细胞处于静止或分化状态，不进行分裂。
当细胞从G1期进入G2/M期时，DNA物质会从2N复制为4N，以供两个子细胞使用。因此，G2期细胞（合成后且分裂前）可通过其DNA含量是G1期细胞的两倍来加以区分。因此，可以基于DNA含量来区分处于细胞周期不同阶段的细胞。这一现象在流式细胞术中已得到充分证实，该技术使用碘化丙啶（PI）等DNA结合染料。此外，已有充分文献记载表明，处于细胞周期早期阶段的细胞比处于后期阶段的细胞体积更小。
细胞周期研究一直是肿瘤学领域关注的重点，旨在阐明细胞的增殖特性。根据细胞周期状态筛选出的细胞可通过RNA-Seq分析，以识别与正常或异常增殖相关的转录本，作为潜在的药物靶点。使用可插入DNA的染料来鉴定细胞周期，不仅会影响细胞的表型，还可能干扰下游的分子生物学实验（如PCR）。因此，最好采用能够避免这些染料潜在干扰的方法。
先前研究表明，对处于细胞周期特定阶段的细胞进行无标记分选是可行的。然而，传统的液滴式细胞分选仪会因高剪切应力而降低细胞存活率和RNA完整性。在本应用说明中， 我们利用WOLF细胞分选仪的高灵敏度及温和的微流控分选技术，在保持高存活率的同时，对处于G1期的Jurkat细胞进行了无标记分选。
为了鉴定未标记细胞的特征，我们首先使用一种染料来界定目标细胞群（下图）， 在G1峰周围绘制了一个阈值门，并进行了高亮标注，以便观察细胞在FSC/BSC图中的位置。 随后，在散射光散点图中将蓝色高亮标注的细胞圈在门内。
分选前，未标记的G1分选门内细胞的平均百分比为 42.9 ± 10.9%。分选后，G1期细胞的平均百分比为 90 ± 2.1%（下图A）。
分选后立即测得的细胞活率为 90.1 ± 7.92%，经24小时孵育后，样本的平均长成率为73.9 ± 17.2%（下图A）。此外，分选出的G1期细胞在经24小时孵育后已进入S期和G2期（下图B）。
WOLF G2单细胞柔性分选系统能够利用荧光染料来测定倍性，通过采用反向圈门策略，在散点图中对特定区域进行圈门分选。由于DNA结合染料具有细胞毒性，且可能干扰基因组检测，我们仅将该染料用作散点图中G1圈门的参考。
该技术在这些实验中被证明是成功的，我们能够获得单一的G1细胞，且分选后的纯度很高。此外，经过24小时的培养期后，细胞看起来健康，并继续进入细胞周期的G2/M期，这进一步证明这些细胞在WOLF单细胞柔性分选系统上分选后没有损伤，保持了其功能。
此外，该工作流程被证实也适用于其他细胞类型。对CHO细胞的细胞周期分析显示，由于其更大的细胞体积和更强的散射信号，散点图中G1和G2群体的分辨率更高。总体而言，这些实验证明WOLF单细胞柔性分选系统足够精确且温和，能够对处于细胞周期不同阶段的活细胞进行分选。
