单克隆性被定义为源自单个细胞的克隆，且可能具有遗传同质性，这是生物制剂生产所必需的。传统的单细胞克隆方法，如有限稀释法，一直采用并依赖泊松统计概率来评估单克隆性。然而，众所周知，该方法耗时较长、速度较慢且通量较低，且需要进行扩增以筛选出理想的细胞候选。此外，由于有限稀释法可能导致每个孔中存在多个细胞，因此需要进行多轮分选以提高单克隆性的概率。
为了更好地确保单克隆性，WOLF G2和N1单细胞分选仪可用于筛选数百万个细胞，并针对目标细胞进行精准分选和单细胞分装，以满足细胞系开发需求，支持多达11项参数的检测。
一种常见的荧光检测方法是使用细胞存活染料来排除死亡细胞，从而提高细胞生长率。DRAQ7是一种远红光细胞存活生物标志物，可与细胞膜受损的细胞中的双链DNA结合。5DRAQ7可被蓝色（488nm）或红色（637nm）激光激发，并发出650- 800nm波长的荧光。在此，我们使用配备488 nm和637 nm配置的双激光WOLF G2系统，结合DRAQ7对GFP+ HEK293细胞进行分选，以在进行单细胞克隆时彻底排除死细胞，从而最大化接种密度和细胞生长。
在使用WOLF G2并采用637 nm配置对GFP+ HEK293细胞进行单细胞分选时，通过DRAQ7排除死亡细胞，观察到平均总生长率为81±3.9%。这比有限稀释法的生长率20±8.1%提高了约4倍（下图）。
在第0天、第7天和第14天对96孔培养板进行分析时，我们确认WOLF G2法产生的单克隆细胞生长率为74±2.9%。与采用有限稀释法制备的培养板中20±7.6%的生长率相比，这一结果提高了3.75倍（下图）。
通过在第0、7和14天使用Celigo分析细胞，来确定单克隆性，从而通过追踪细胞生长形成细胞株，追溯性地确认所检测到的颗粒确实是细胞。此外，多日测量还证实了含有单克隆的孔源自单个细胞（下图）。
最后，总生长率与我们先前使用WOLF对GFP+ HEK293细胞进行分选（未使用存活染色剂）所得的结果一致。该次研究中，平均总生长率为78±5.5%（下图）。
这些结果并不令人意外，因为这两个系统都采用相同的微流控和分选机制，唯一的区别在于激光器的数量和检测通道的数量。
在本研究中，我们证明了与有限稀释等传统方法相比，WOLF G2能够确保更高的单克隆性。本文介绍了WOLF G2的488 nm和637 nm激光配置的应用。WOLF G2还提供488-405 nm和488-561 nm配置，以支持多种遗传标记、传统染料及新兴化学试剂，从而满足细胞系开发以及其他克隆或样本制备工作流程的需求。
