微生物在所有生物体中最具多样性。大多数微生物尚未被探索，其蕴藏着巨大的潜力。本文提出了一种基于单细胞分离与遗传特征分析的微生物暗物质探索工作流程。通过B. sight进行单细胞分选，可实现无标记微生物分离。随后进行的单细胞全基因组扩增采用多重置换扩增（MDA）技术。通过将单个细菌精准分配至PCR板，并结合无接触低体积液体处理装置I.DOT，仅需350纳升细胞裂解液即可完成细胞裂解，并可将扩增反应体积缩减至原体积的1/20，显著降低实验成本。对16S rRNA基因进行下游测序，可实现分离细菌细胞的分类学鉴定。由于所有步骤均在标准微孔板中完成，该工作流程可轻松扩展至分析数千个独立微生物个体，无需培养即可深入探究复杂微生物样本的组成与异质性特征。
微生物生物圈的估计多样性介于105至1012个不同物种之间。虽然部分重要代表物种已被充分研究和表征，但绝大多数微生物仍属未知。对未知微生物物种的表征具有高度科学价值，其潜在价值在于发现新的代谢途径或调控机制，从而可能催生新型治疗手段。该研究也有助于更深入理解微生物群落的组成及其潜在相互作用。目前分离纯化微生物的常规方法依然是极限稀释法或琼脂平板划线法，但在通量和自动化能力方面远不及需求。此外，对培养及后续表征而言为单个微生物寻找适宜生长条件也颇具挑战。尽管在改良培养方法方面已取得重大进展，但估计数据显示仍有99%的微生物物种尚未被成功培养。
培养过程耗时过长或因代谢系统高度复杂而无法实现，针对这些不可培养物种的基因分析，科研人员开发了独立的培养方法。鸟枪法测序与宏基因组组装基因组的后续重建技术以及单细胞基因组学方法，为揭示这些不可培养物种的身份特征和基因组结构提供了重要线索。尽管鸟枪法测序通常用于批量处理复杂样本，但在高丰度物种的庞大样本中，稀有生物或亲缘物种间的细微差异可能被忽略（Woyke ，2017）。通过分离表征单细胞样本可避免此类偏差，因此成为反映复杂样本原始异质性的首选方法。
我们开发了一种高通量工作流程，用于从人类痰液样本中无标记分离单个微生物，随后通过微型化反应进行全基因组扩增及16S rRNA基因序列扩增，以实现分类学鉴定。
痰液样本采集自健康受试者。样本经PBS稀释10倍后，通过10 μm 膜过滤。过滤后，样本以4000g离心10分钟，弃去上清液，沉淀物重悬于40 μL 过滤的PBS中，随后装入新的无菌袋式分装盒。使用配备自动偏移校正（AOC）模块的B. sight分选仪，将单个微生物细胞分装至384孔PCR板中。分选参数设置为粒径范围0.5-10 μm 、圆形度0.1-1，以获取复杂混合物的完整形态学特征谱。
细胞裂解与全基因组扩增（WGA）反应采用 REPLI -g单细胞试剂盒（Qiagen）完成，该试剂盒基于多重置换扩增技术实现基因组DNA的等温扩增。使用I.DOT或I.DOT Mini分配试剂后，反应体积较原始方案缩小20倍（见表1）。为避免潜在DNA污染的扩增，所有试剂在分配前均经紫外线照射（Stratagene Stratalinker）60分钟（Woyke ，2011）。扩增反应在30°C下运行12小时，随后在65°C下处理5分钟以灭活聚合酶。
DNA浓度测定采用Quant-iT PicoGreen双链DNA检测试剂盒（Invitrogen）。样品按1:20比例稀释后，取1 μL 加入10 μL PicoGreen工作液中。使用λDNA配制的标准曲线通过采用I-DOT或I-DOT Mini进行定量分析。荧光强度使用Spark多模式微孔板读数仪（Tecan）进行测量。
使用One使用在线工具Silva-ARB（www.arb-silva.de）将Sanger测序序列与SINA数据库中的silva RefNR SSU序列进行比对。系统发育树通过PhyML 3.1（Guindon ，2003）构建，采用100次自举重复计算分支支持值。编写了定制Python脚本用于将序列ID替换为属名或科名、合并重复出现的分类单元，并绘制系统发育距离树。最后使用iTOL可视化工具（Leitunic ，2019）完成树形图绘制。
所有全基因组扩增（WGA）试剂均采用即时滴加技术（I. DOT）进行分配。该技术可在亚微升范围内实现快速全自动化的试剂定量，其高精度与低体积分配特性可将细胞裂解和全基因组扩增反应步骤的体积缩减至原体积的1/20，从而节省成本与时间。与原始方案相比，减量后的体积数据详见表1。由于WGA基于非特异性引物与扩增，避免核酸污染至关重要。无接触分配技术可有效规避这些高灵敏度DNA扩增步骤中的交叉污染。PicoGreen检测中阴性对照反应未检出DNA，证实扩增反应无污染。
为对分离的原核生物进行系统发育分类与鉴定，我们对编码16S rRNA的基因进行了扩增。在344个样本中，有157个样本在aga玫瑰胶上显示出约1550 bp的可见条带，该长度对应16S rRNA基因的平均大小。在无法扩增16S rRNA基因的孔中，尽管在喷嘴处检测到单个细胞，但扩增可能因细胞裂解不足或片段从MDA中提取的WGA DNA具有条带化特征。此处靶向的16S rRNA序列长度为1465 bp，因此相对较长。若该区域发生片段化，则无法进行扩增。PCR产物的纯化与Sanger测序在Eu rofins Genomics以95个样本为一批次完成。
将获得的16S rRNA基因序列与silva RefNR SSU参考数据库进行比对以进行分类学鉴定。图4展示了样本中细菌在门水平的分布情况。共有77条序列符合测序质量标准并被纳入比对分析。丰度最高的门类为厚壁菌门（35%）和拟杆菌门（35%），其次为变形菌门（17%）和放线菌门（16%）。样本的系统发育树展示于图4中。与人类口腔微生物组数据库（Chen ，2010）的比对结果显示，有7条序列与未培养细菌高度同源：其中两条序列分别与细菌 HMT 352（99.9%和99.6%同源性）、弯曲杆菌属 HMT 044（99.7%）、瘤胃球菌科[G-1]细菌 HMT 075（99.5%）、瘤胃球菌属[G-2]细菌 HMT 085（99.7%和99.8%）以及异前拟杆菌属 HMT 913（98.9%）具有同源性。
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通过将B. sight与I. DOT/I. DOT Mini结合，我们建立了一种用于单细胞全基因组测序的自动化高通量工作流程。
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该仪器的小型化设计使用户能够在流动工作台中完成整个工作流程，从而降低污染风险。
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单细胞分装技术可实现从复杂微生物样本中无标记地分离单个细菌。
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采用AOC与平板去离子技术实现单细胞精准沉积，可在标准384孔板使用仅350纳升裂解缓冲液处理。
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采用I. DOT技术，我们将WGA反应体积缩减了20倍，并显著降低了此类分析的成本。
