指数型 DNA 扩增技术在超灵敏分子诊断中占据着基础地位。这些系统具有广泛的动态范围，但定量分析需要实时监测扩增反应。线性扩增方案尽管灵敏度有限，但能够通过单个终点读数实现定量测量，适用于低成本、现场检测或大规模检测。因此，将指数型扩增的灵敏度与终点读数的简便性相结合，将能够突破一个主要的设计难题，并开辟新一代大规模可扩展定量生物测定法的途径。在此，介绍了一种基于核酸的混合电路设计，用于计算对数函数，从而基于单个终点测量提供广泛的动态范围。
CELIA（将指数型扩增反应与线性扩增相结合）利用一种多功能的生化电路架构，在一锅式反应中将可调线性扩增阶段（可选择嵌入反相器功能）连接到指数模块下游。应用于微小 RNA 的检测时，CELIA 提供了检测限值。其范围为飞摩尔级别，动态范围达六十年之多。这种恒温方法无需借助热循环仪即可实现检测，同时又不降低灵敏度，从而为各种诊断检测应用开辟了道路，并为定量核酸分析提供了一种简化、成本效益高且高通量的解决方案。
比较了各种扩增方案在对目标物质进行系列稀释时的灵敏度（S）、定量性（Q）以及读出方式（实时，rt 或终点，ep）。
A）指数扩增能够实现高度灵敏的目标检测，但需要实时监测扩增反应以提供定量信息。B）终点分析的指数扩增反应具有成本低和读出速度快的优点，但信号饱和速度过快，无法获取定量信息，因此仅适用于定性分析。C）线性扩增可用于终点目标定量分析，但由于扩增倍数较低，灵敏度有限。D）所提出的 CELIA 方法将指数扩增的灵敏度与线性扩增带来的便利性和较低成本（用于终点读出）相结合。这是通过在指数放大器之后有条件地实施一个线性放大阶段来实现。水平和垂直的蓝色线条分别对应所选的放大信号阈值和结束时间。
指数级的 DNA 扩增方法是超灵敏分子诊断技术的基石。聚合酶链式反应（PCR）是这一领域的最具代表性实例，与此同时等温扩增方案迅速发展，也提供了极具前景的替代方案。例如，环介导等温扩增（LAMP，主要用于快速检测 SARS-CoV-2），指数滚动环状扩增（eRCA，它利用具有进程性和链移位酶（如 Phi29 DNA 聚合酶）来实现），这些都能实现从少量核酸靶标（如几个拷贝）到容易检测的浓度（通常通过光学读数实现）的指数级过程——通常通过实时动力学监测反应来提取扩增时间（例如 qPCR 的循环阈值，Ct），该时间与初始靶标浓度呈对数关系（图 1A）。因此，这些指数型检测方法提供了卓越的动态范围（高达 8 个数量级）。虽然存在一种更为简单的端点测量方法，但这种方法会极大地降低动态范围，并且通常仅用于获取定性（是/否）信息，主要是因为指数放大信号很快就会达到饱和（图 1B）。
相比之下，诸如 RCA 或链置换扩增（SDA）这样的线性放大方案允许进行定量的端点读数。然而，由于信号的缓慢、线性积累，这些方法的灵敏度远低于其指数型对应方法，并且提供的是线性动态范围（图 1C）。
在本研究中，我们设计了一个模块化的 DNA/酶基反应网络，能够对核酸靶标进行定量的端点测量，同时保持指数策略的灵敏度和宽动态范围。该概念依赖于将指数放大反应与线性放大阶段相结合，并具有可调增益（CELIA，图 1D）。
RCelia 用于灵敏且定量的终点检测。RCA 类型 A）由 miRNA 目标（let-7a）触发。RCA 产物的切口会产生短的 DNA 片段，这些片段用于装载其他环形模板。指数型 RCA 的输出α ’ 引发了在环形模板 RCα 上的二次线性 RCA。这个 RCA 产物与一种前荧光分子信标 MBα配对，后者用于报告反应的进程。B)不同 let-7a 浓度下的指数扩增（左图，使用双链特异性染料 SYBR 绿进行监测）和线性扩增（通过 MBα荧光进行监测）的时间轨迹。可以注意到，随着扩增程度的增加，RCelia 指数扩增效率以及线性扩增增益均有所下降。然而，线性阶段在短暂的加速阶段后会达到恒定速度。这些观察结果表明，对于 α’ 的指数复制而言，必需的切口酶的酶活性有所下降，但在线性阶段则并非如此。C) 终点 MBα 荧光强度与 At 的关系。D）终点信号与 let-7a 目标浓度的关系。
我们构建了RCelia 方案，其中一种名为“尼克酶辅助指数型 RCA 反应”的反应与另一种仅基于线性的 RCA 反应相结合（图 A）。指数型 RCA 由目标 miRNA（let-7a）启动，并通过 DNA 聚合和沿着环形探针 RCA 的切割产生一个短的线性输出（α’）。α’ 启动了沿着第二个环形探针（RCα）的线性RCA 反应。与所展示的 DNA 电路类似，当α’ 在达到饱和水平时（通过双链特异性染料 SYBR Gold 监测）进行指数级放大，下游反应会以与 miRNA 浓度的对数线性相关的方式恢复信号，从而实现终点定量测量，检测限在皮摩尔范围以内，受到 RCA 反应非特异性启动的限制（图 6B - D）。
这种定量终点读出模式将显著减少光学仪器运行时间的负担，并提高样本处理量。例如，对于典型的RT-qPCR 测定来说，在 96 孔板中进行的 miRNA 测量需要使用实时热循环仪进行 2 小时的处理，这样在 24 小时内可以处理最多 1152 个样本，且各次检测之间不会出现时间间隔。由于切换到端点读数模式后，培养步骤可以大规模进行（例如在低成本培养箱中），而光学仪器仅用于培养后的测量。若每次测量间隔为 2 分钟，则处理效率可提高 60 倍，从而能够每天测试近 70，000 个样本。
文章中miRNA样本合成步骤：从 10⁻⁴到 10⁻² 的对数区间内随机选取 let-7a 与 miR-203a 的浓度组合。利用自动化液体工作站（I.DOT Deepwell，Dispendix）将不同RNA分配到384 孔板，每个样本均设置复样，同时分别加入 let7a 或 ratior 转换模板。此外，还为每种 miRNA 构建了校准曲线：将 miRNA 按 10 倍梯度从 10⁻⁹稀释至 10⁻²（包含两端点），每个稀释度设置 3 个复孔。
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