单克隆抗体的亲和性优化对候选药物的开发至关重要，因为它会够影响药物的疗效，进而影响药物剂量和给药方案，减少副作用以及降低治疗成本。本文通过定点突变以及酵母展示，展示了EGFR X PD-L1 “Two-in-One”抗体与EGFR结合的亲和性成熟。由于轻链CDR3区域单个氨基酸的突变，经筛选的抗体突变株与EGFR结合的亲和性提高了60倍。该抗体的结合性能通过各种方法进行了验证，包括BLI测量，在含有重组蛋白混合物的表面上进行实时抗原结合测量，以及使用流式细胞术进行细胞结合实验和实时的相互作用细胞动力学实验。一个以AlphaFold为基础的模型预测酪氨酸到谷氨酸的氨基酸改变能够使得抗体与EGFR 第165位精氨酸形成盐桥。这种较易执行的操作为双特异性抗体与其中一个抗原结合的亲和性成熟提供了一种方案。
在过去几十年，单克隆抗体对于多种疾病的治疗已经成为一种重要的选择。为了提高效果和减少副作用，抗体和抗原结合的亲和性和特异性是非常重要的。抗体的抗原结合部位由六个互补决定区（CDRs)组成，重链三个，轻链三个。在抗体亲和成熟的过程中，CDRs发生了体细胞高频突变。在哺乳动物中，高亲和性的抗体产生于激活的B细胞中，在免疫球蛋白（Ig) 基因可变区产生突变多样性，这个过程称为体细胞高频突变（SHM）。由于Ig基因的随机SHM和含有亲和增强突变的B细胞的选择和克隆扩增之间的交替过程，使得高亲和性抗体在免疫应答中大量增加。
治疗性抗体可有多种来源，比如小鼠，大鼠，兔子，鸡或非人灵长类。动物免疫的优势是抗体在体内已经通过几轮的SHM发生了亲和成熟。然而，即使是在体内产生的抗体，其亲和性也可能不满足与抗原的结合，这才需要在体外进行亲和成熟优化。因此，通过易错PCR从天然抗体中产生一系列的突变体，这些突变的发生是随机的而非选择性的。
靶向诱变法通过定点突变产生一个抗体突变体文库，该突变能够被设计只发生在CDR区域。最成熟的抗体突变体能够通过使用展示淘选技术，例如噬菌体展示，酵母展示或核糖体展示这种亲和筛选过程进行分离。然而，对于一个包含可变域的所有CDRs的单点和多点突变的所有可能组合的文库，所需的库规模将超过 10^30 个变体，这使得使用常规的展示技术进行筛选变得不可行。热点突变和同时诱变等是提高CDR多样性效率和减少文库规模的方法。
突变法已经应用在多种提高抗体结合亲和性的研究中。Tillotson et al通过易错PCR使用随机突变法结合酵母展示筛选，分离出靶向transferrin受体（TfR）的单链可变片段（scFv)突变体，其结合亲和性提高了3-7倍。Beucken et通过易错PCR产生的文库及酵母展示技术分离出一组链霉素四价抗原的Fab抗体片段，亲和性提高了10倍。Hu et al利用了针对人源化抗受体酪氨酸激酶 2（ErbB2）抗体多个CDR定向突变多样化策略，并结合噬菌体展示技术，筛选出了一个亲和力提高 158 倍的突变体。
对于双特异性抗体（bsAbs), 药物需要针对两个抗原进行亲和性优化。双特异性抗体是值得关注的肿瘤治疗方案，因为它们能够交联受体或封闭两个疾病相关的信号通路。通过靶向相同肿瘤细胞上的两个癌症特异性抗原，能够提高双特异性抗体的肿瘤特异性。两个治疗性靶点PD-L1和EGFR在许多实体瘤中表达上调。作者最近报道分离了一种鸡来源的同时靶向PD-L1和EGFR的“Two-in-One”（HCP-LCE）抗体，该抗体在单个Fab片段上有两个独立的抗原结合点。“Two-in-One”是由两个同样的重链和轻链组成的对称性分子，意味着不需要对恒定链进行额外的基因工程改造。这种抗体是首个分别给两只鸡免疫EGFR和PD-L1的细胞外结构域而分离出来的“Two-in-One”抗体，将各自的重链和轻链部分结合形成Fab的形式并分离出能够同时结合两个靶点的抗体突变体。HCP-LCE通过结合到二聚化结构域II抑制EGFR信号阻止PD-1/PD-L1的相互作用，对每种抗原都展现出适度的个体亲和性。
本文中，作者研究了是否能够对该“Two-in-One”抗体与EGFR的结合亲和性进行优化的同时没有丢失与PD-L1的结合。据文中所提，这是第一次对通过动物免疫和组合筛选获得的“Two-in-One”抗体进行亲和成熟。作者通过定点突变和酵母展示结合流式细胞分选优化HCP-LCE与EGFR结合的亲和性。通过随机对轻链CDR1（LCDR1）和CDR3（LCDR3）的单个氨基酸进行突变，分离出的“Two-in-One”突变体与EGFR的结合亲和性提高了60倍，该突变体在LCDR3的第3位发生了单个氨基酸的取代，而与PD-L1的结合亲和性没有受到影响。AlphaFold为基础的模型预测提高的亲和性是由于形成了一个额外的盐桥。
在本文中，对于双特异性抗体亲和性的检测，文中采用了BLI技术以及swithSENSE技术；同时为了更深入的理解该抗体与活细胞表面的抗原结合动力学，以期望在细胞原生态的状态下获得相关数据，本文采用了RT-IC技术分别对表达两种抗原的不同肿瘤细胞系与抗体结合的实时动力学和亲和性进行了测量。
“Two-in-One”抗体HCP-LCE与EGFR结合部分是通过对一个鸡来源的酵母表面展示文库的筛选而产生，然后将抗PD-L1抗体的重链和一种免疫型抗 EGFR 轻链库相结合（请见Figure 1A)。
Fig. 1A/B “Two-in-One”抗体的结构设计和突变株构建
由于HCP-LCE以相同的Fv区域同时靶向EGFR和PD-L1，与PD-L1的结合主要是通过重链的CDRs实现，我们推测轻链的互补决定区主要参与与 EGFR 的结合。因此，为了“Two-in-One”抗体 HCP-LCE与EGFR结合亲和性成熟，通过LCDR1和LCDR3区域的随机氨基酸突变产生一个酵母展示文库（请见Fig 1B)。因此，该酵母展示文库具有一种特性，即在LCDR1的九个氨基酸中任何一个上可能存在突变，在LCDR3的十二个氨基酸中的任何一个上可能存在突变，导致每条轻链具有两个突变的最大突变率。以500nM的EGFR-Fc起始，通过FACS对“Two-in-One” LC NNS 文库中高亲和力的EGFR结合子进行三轮连续的筛选（请见Fig 1C)。
Fig 1C FACS筛选高亲和性EGFR结合子
利用switchSENSE技术检测HCP-LCE和LCE-E与表面单抗原和双抗原结合的实时动力学。LCE-E为筛选后产生的一突变株。与靶点蛋白偶联的DNA链与荧光探针标记的适配链进行杂交，然后与芯片表面的锚定链进行杂交（请见示意图）。底物的结合通过荧光信号接近感应检测，该荧光信号对环境变化敏感，底物结合将导致荧光信号淬灭（请见Fig 2A-2D)。
switchSENSE技术原理示意图
Fig 2A-2D switchSENSE技术检测表面单抗原和双抗原实时结合动力学
switchSENSE技术的优势之一为该技术为双参数通道检测，能够利用不同的荧光探针标记两种不同的抗原，并可以借助DNA互补配对的优势，将双抗原按照不同的比例随机且均匀分布在芯片表面，实现灵活性的构建单抗原结合表面，双抗原结合表面以及双抗原按照不同比例分布的结合表面（请见示意图）。
switchSENSE技术利用碱基互补配对和双色检测系统形成不同的抗原比例结合表面示意图
从Fig 2A-2D我们可以看到该“Two-in-One”抗体表现出双向解离模式，谷氨酸引入LCDR3区域（LCE-E突变体）减少了快解离带来的影响，稳定了抗体与EGFR的结合（请见Fig 2C)。我们对表面偶联一个抗原和芯片表面偶联两个抗原时的结合动力学进行了深入的比较（请见Table 1)。针对该抗体，抗原的展示差异并未影响抗体的结合动力学。
Table 1 switchSENSE对芯片表面展示双抗原及单抗原结合动力学比较
实时相互作用细胞术（RT-IC）能够检测与野生型的HCP-LCE相比，EGFR结合动力学的提高对突变株LCE-E与抗原阳性肿瘤细胞结合动力学的影响。RT-IC技术与上述提到的switchSENSE技术均来自Dynamic Biosensor，该技术是首款能够利用活细胞进行实时动力学检测的技术（请见原理示意图)。
RT-IC技术利用活细胞检测抗原/抗体结合的实时动力学示意图
通过两种不同的表达EGFR和PD-L1的双阳性肿瘤细胞系A431和A549进行结合动力学的检测。A431细胞系与A549相比，表达更高水平的EGFR和PD-L1。对于两种细胞系，EGFR的表达都高于PD-L1。当细胞被芯片捕获后，荧光标记的抗体在微流控系统中与细胞进行结合。抗体的结合通过荧光信号的增加进行检测，在反向液流的作用下，底物发生解离，荧光信号降低。两种抗体（HCP-LCE和LCE-E）都与A431和A549进行结合并检测（请见Fig 3A-D)。
Figure 3A-D RT-IC技术检测Two-in-One抗体及其突变体与肿瘤细胞系的实时动力学
在大多数情况下，解离都表现出双向解离模式，慢解离占主导作用（请见Fig 4)。对于HCP-LCE和A431细胞的结合，使用慢解离常数（KD2）计算的解离常数范围为0.1-0.7nM，其他的测量结果请见（Table 2)。在 A431 细胞上测定的 HCP-LCE 的 KD2 值较低，这是由于其结合速率更快所致(请见Fig 4A,B)。
Table 2 RT-IC技术检测抗体与不同肿瘤细胞系的实时结合动力学和亲和性
在两种细胞系上，LCE-E都展现出更慢的第二解离速率（请见Fig 4C，D)以及第二解离期对整个解离过程的贡献值更小（请见Fig 4C)，总体上导致亲和成熟后的抗体在细胞上滞留时间的增加（请见Fig 4D)。
Fig 4 “Two-in-One”抗体与不同肿瘤细胞系结合动力学分析
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