我们发现sirtuin重排配体（SirReals）是RAD+依赖性的Lyrtuin脱乙化酶Sirt 2的高效和选择性抑制剂。使用生物素化的SirReal结合生物层干涉测量法，我们之前观察到载体-酶复合物的缓慢分解速度，这被认为是SirReals高亲和力和选择性的关键。然而，为了将生物素连接到SirReal核心，我们引入了三唑作为连接部分，X射线共晶体学表明其与辅因子结合环的Arg 97相互作用。在此，我们的目标是阐明观察到的SirReals的长停留时间是主要由三唑掺入引起的，还是SirReal抑制剂核心的固有特征。因此，我们使用基于电可切换DNA纳米层的新型无标签switchSENSE®技术来验证SirReals的长停留时间确实是由核心支架引起的。
蛋白质受到各种翻译后修饰(PTMs)。这些修饰使得蛋白质活性、定位、相互作用和稳定性的微调成为可能。赖氨酸残基ε-胺的乙酰化具有与磷酸化相似的复杂性和细胞重要性，已成为最丰富的蛋白质PTMs之一。赖氨酸乙酰化由赖氨酸乙酰转移酶(KATs)安装，并由赖氨酸脱乙酰酶(KDACs)去除。除了乙酰基之外，还可以通过上述赖氨酸修饰酶安装和去除更长的酰基链，包括丙酰基、丁酰基和肉豆蔻酰基，或衍生自二羧酸如丙二酰基、琥珀酰基或戊二酰基的酰基。然而，值得注意的是，也有相当数量的非酶赖氨酸酰化。在人类基因组中已经鉴定了18种不同的KDACs，并根据它们的序列同源性分成四类。Sirtuins构成了第三类KDAC，是KDAC家族中非常特殊的成员。I类、II类和IV类脱乙酰酶是Zn2+依赖性金属蛋白酶，而7种人sirtuins同种型(Sirt1-7)共享NAD+依赖性催化机制。在催化反应过程中，sirtuins经历了从脱辅基酶的所谓“开放构象”到(假)底物结合状态的“封闭构象”的重排过程。同型Sirt2主要位于细胞质中，并显示出脱乙酰化多种底物，如α-微管蛋白、BubR1、p53、eIF5A、和nfκb。sir T2依赖性脱乙酰化对细胞周期调节、自噬、外周髓鞘形成、以及免疫和炎症反应具有重大影响。除了脱乙酰化，Sirt2还催化长链脂肪酸的去除，据报道，与脱乙酰化相比，脱酰化的催化效率甚至更高(kcat/Km)。然而，许多最近的报告也表明Sirt2的整个细胞议程不仅依赖于其催化活性，还依赖于其与结合配偶体如KDAC6或TTTP/p25的蛋白-蛋白相互作用(PPI)。Sirt2的失调与几种疾病状态有关，包括细菌感染，II型糖尿病，神经退行性疾病，和癌症，从而突出了sir T2作为药物干预的有希望的靶标。然而，对于一些疾病情况，包括亨廷顿氏病[21]和一些癌症类型，尚未最终阐明Sirt2是否必须被上调或下调，分别被抑制以改善特定的疾病状况。迫切需要合适的工具化合物来进一步研究Sirt2脱乙酰化的细胞效应，并验证Sirt2作为药物靶点，这导致了许多药物样Sirt2选择性小分子抑制剂的发现，这些抑制剂已在其他地方进行了综述。最近，我们发现了一类新的高选择性Sirt2抑制剂(图1A)。这些化合物在低微摩尔至纳摩尔范围内导致Sirt2抑制，而对于它们的封闭同系物Sirt1和Sirt3或其他同种型，没有观察到可检测的抑制(IC50 > 100 M)。与1或2复合的Sirt2的共晶体结构(图1A)是Sirt2与Sirt2选择性药物样抑制剂复合的第一个晶体结构。。该数据揭示了一种独特的抑制模式，其特征在于配体结合时Sirt2活性位点的主要重排(见图1B和图S1)。作为重排的结果，一个新的结合口袋由铰链区的两个环形成，其连接Rossmann折叠结构域和锌结合结构域。这种现象仅在Sirt2中观察到，并归因于Sirt2在活性位点的这一特殊区域中的独特灵活性。因此，这类抑制剂被称为Sirtuin重排配体(SirReals ),形成的诱导型fit结合口袋被称为选择性口袋，因为它被确定为Sirt2选择性的关键。在我们报道Sirt2中选择性口袋的存在后不久，显示该口袋容纳肉豆蔻酰基底物的长链脂肪酸。同时，其他Sirt2抑制剂也显示出通过与选择性口袋结合而获得其同种型选择性。SirReal-Sirt2共晶体结构显示配体结合到选择性口袋阻止构象从开放到封闭构象的转换，对此感兴趣，我们假设sir real将sir T2楔入其开放构象(“锁定-开放构象”)，并反过来被该过程捕获。其揭示了非常慢的解离动力学(图1C)，表明Sirt2确实将结合的SirReal捕获在其活性位点，这是其在配体结合时构象适应的结果。
这导致配体在其靶上的长停留时间(即配体-蛋白质复合物的寿命)，并导致缓慢的解离(图1C)。发现配体结合时靶蛋白的构象适应可以极大地影响停留时间，这与报道的文献一致。此外，增加停留时间被认为是优化细胞活性的药物设计的关键策略。然而，如Sirt2与基于三唑的SirReal (5)的复合物的共晶体结构所示，在标记过程中作为接头部分引入的三唑部分也通过特异性相互作用参与Sirt2结合。三唑与辅因子结合环的Arg97形成氢键(图1B)。为了探究Sirt2亲和探针(4)的长停留时间是引入三唑部分的结果还是主要归因于SirReal核心，我们正在寻找一种能够在无标记方法中确定结合动力学的技术。
图1.Sirtuin重排配体(SirReals)通过活性位点重排与Sirt2结合，导致缓慢的关闭动力学。a)选定的SirReal(1-3)、SirReal衍生的亲和探针(4)和基于三唑的sir real类似物(5)的化学结构。B)sir real 2(2，绿色，PDB-ID: 4RMG)和基于三唑的SirReal (5，青色，5DY5)结合Sirt2的结合模式的叠加。氢键显示为紫色虚线。相互作用的残基显示为棒状，相互作用的水分子显示为红色球体。为了清楚起见，省略了残基103-112。在图S1中提供了2和4的结合模式的图示，其覆盖了结构的较大部分。c)显示不同浓度的Sirt2与固定的SirReal衍生的亲和探针结合的代表性生物层干涉测量传感图(5)。
为了通过不需要标记配体的方法研究Sirt2-SirReal相互作用的结合动力学(kon，koff速率常数),我们利用了基于DNA纳米水平的switchSENSE技术。这种方法的灵敏度足以监测未标记的小分子与表面束缚蛋白的结合。在我们用于研究的实验装置中，Sirt2共价结合到移植到金微电极表面的双链短DNA纳米杆的一条链上。另一条链用荧光染料标记，在这种情况下是Cy3(图2A)。一般来说，这种设置可以用于两种不同的测量模式。在静态模式下，配体与表面束缚蛋白的结合通过结合事件直接导致的DNA结合荧光团的荧光发射变化来监测。然而，值得一提的是，不直接影响DNA结合的荧光性质的结合事件荧光团不能通过这种测量模式来监控。在SirReal-Sirt2相互作用的情况下，静态模式测量没有产生任何可用于进一步评估的结合数据(数据未显示)。因此，我们使用了switchSENSE技术(动态模式)来进一步表征SirReal-Sirt2相互作用的结合动力学。switchSENSE技术利用施加在金微电极上的交流电势，可以吸引或排斥双链DNA纳米杆的负电荷骨架。
图2.通过开关传感技术探测固定的Sirt2和未标记的SirReal2 (2)之间的相互作用。a)实验装置的动画演示。b)由不同浓度的SirReal2诱发的固定化Sirt2的热稳定性(2)。关于熔化曲线及其评估，请参见图S3。实验细节在实验部分提供。c)固定化Sirt2与SirReal2 (2)的结合(左)和解离曲线(右)。实心圆代表原始数据，全局拟合用蓝线表示。
这产生了DNA纳米杆方向的振荡变化，称为转换。由于与距离相关的无辐射能量转移到金，染料发出的荧光强度报告了其到金表面的距离。换句话说，荧光团越靠近猝灭金表面，发出的光越少。改变结合蛋白的流体动力学摩擦的过程(例如，配体结合、构象重排、热变性)影响DNA运动的速度，从而导致开关动力学的变化。
在我们的动力学测量之前，我们的目的是询问，固定过程是否影响Sirt2的结构完整性，从而影响其配体结合特性。因此，我们利用switchSENSE技术评估了SirReal2 (2)存在和不存在时系留Sirt2的热稳定性(见图2B)。即使在低微摩尔配体浓度下，SirReal2 (2)对固定化Sirt2的热稳定性也表明了适当的折叠和配体结合性质。受束缚的Sirt2的热稳定性是浓度和时间依赖性的(图2B)。值得注意的是，使用switchSENSE技术可以在3.3-10 M的浓度下检测到显著的热位移(T～3°C)，而使用SYPRO Orange染料结合未束缚Sirt2的标准荧光热位移分析(FTSA)仅在25 M的更高化合物浓度下产生类似的位移(T～3°C)[24a]根据热稳定性分析的结果， 我们的动力学测量是在2-20 M的配体浓度范围内进行的。通过switchSENSE技术(动态模式)，我们观察到未标记的SirReal2 (2)从固定化的Sirt2中非常缓慢地解离(图2C)。 此外，对于不同浓度的SirReal2 (2，2M–20M)，我们获得了kon和koff速率常数以及Kd值(见表1 ),与之前报道的Sirt2与我们标记和固定的SirReal亲和探针之间的相互作用数据相比，该相互作用的范围非常相似(4，kon = 6.9±0.22×103M-1s-1，koff = 7.0±0.31×10-4s-1，Kd = 0.10 M)。通过分析记录的数据集，我们获得了速率常数kon = 7.7±0.2×102M-1s-1，koff = 4.1±0.1×10-4s-1，这给出了总解离常数Kd = koff/kon = 0.53±0.02M。该Kd值与SirReal2 (2)的IC50值非常一致；IC50 = 0.44m为了进一步证实SirReal的长停留时间是配体核心本身的固有特性，而不是由三唑与Arg97的额外氢键相互作用引起的，我们通过switchSENSE技术测定了含三唑的SirReal类似物5的动力学参数(见图S4)。所获得的koff常数为7.9±0.6×10-4s-1，与通过biolayer干涉测量法和switchSENSE技术分别测定的基于三唑的SirReal的亲和探针(4，koff = 7.0±0.31×10-4s-1)和SirReal2 (2，koff = 4.1±0.1×10-4s-1)的koff常数高度一致。因此，我们能够证明先前报道的SirReal-Sirt2相互作用的长停留时间是SirReal核心本身的固有特征，既不是掺入三唑部分的结果，也不是应用的测量技术的人工产物。
通过证明SirReal核心(足以诱导Sirt2活性位点的结构重排)[24a]是这类抑制剂缓慢关闭速率的主要驱动因素，我们能够增加另一个重要证据，即配体结合时的构象适应大大增加了结合配体的停留时间，最终导致高选择性和高亲和力的药物-靶相互作用。有一个新的争论，长停留时间(koff)是否真的是比单纯的效力或亲和力(IC50或Kd)更好的药物开发成功的预测因素，但我们的研究表明，作为诱导适合机制的结果，长停留时间可能是靶选择性的重要驱动因素，这是现代药物发现中最关键的参数之一
