三色“鸡尾酒”混合探针与switchSENSE技术解析血浆白蛋白-药物互作及药物诱导的结构变化

人体的一系列生理过程依赖于细胞组分与相应分子之间的识别和相互作用。一种生物分子与其他分子之间存在多个结合位点或相互作用的模式，因此，需要能够精确的鉴定相互作用的空间定位以及结合/解离动力学。在本文中，我们进行了一项三色荧光结合及竞争实验，可以用于检测做为转运和结合蛋白的人血清白蛋白上的三个独立结合位点的监测和定位。通过独立的X射线晶体以及时间分辨动力学测试（switchSENSE)，确认了该检测的有效性，包括对结合位点的定位以及揭示了配体结合相关的构象变化。这种分析系统能够对白蛋白-结合药物进行详细的特性分析，因此非常适合用于预测药物与药物或药物与食品之间的相互作用。此外，也能够实现对结合诱导的构象变化进行分析。

人血清蛋白（HSA)是一种广泛存在的血浆蛋白质，能够转运像脂肪酸一类的疏水性内源配体。它也和多种药物以及药物类似物的小分子相互作用。在这种生物分子内，几个关于配体和HSA复合物的晶体结构揭示了HSA上存在的七个单独的脂肪酸结合位点。前期，通过引入及应用全新的分子探针NDB-FA，我们分析了与配体结合相关的HSA上结合位点的特异性，在生理条件下，一个白蛋白分子仅可容纳0.1-2个脂肪酸分子。与使用过量的自由脂肪酸稳定白蛋白的构象这种标准化晶体化条件相反，我们在接近先前用于测量白蛋白复合物（NBD-FA:HSA 6:1）KD值的条件下获得了X射线晶体结构（PDB 6ezq,分辨率2.4 Å）。为了更进一步了解白蛋白中结合位点的逐步占据情况以及这些位点和生理学和药代动力学的相互关系，我们进一步寻求一种快速的光学检测方法。这种方法在与配体相互作用时，应能够同时监测不同的白蛋白结合位点。因此，比起当下普遍使用的白蛋白结合检测方法，它可以提供更多的信息用于理解和优化这些相互作用。

除了以前发表的用7-nitrobenzo-2-oxa-1,3diazole（NBD）标记脂肪酸做为分子探针，需要更多的位点特异性荧光配体作为额外的探针，用于分别标记白蛋白上“Sudlow-site II”布洛芬结合位点和华法林结合位点（Sudlow-site-I）。这些新的标记应与已存在的NBD-FA探针有最小的光谱重叠，以便能够进行选择性的光谱检测和具备相似的结合亲和性。它们的结合曲线应展示清晰的平台期，表明和相应的白蛋白结合位点为特异性结合，此外，必须在Job-plots上展现1:1的结合化学计量比。最后，需要进行关于新鉴定的分子探针和已知的白蛋白位点特异性结合子的竞争性实验，以明确将这些探针归类到已知的白蛋白结合位点上。这些新的探针分子应该能够以浓度依赖的方式释放已知的荧光配体。

近期，几篇发表的文献报道了BODIPY（4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-sindacene）染料的合成和应用，它展现出了和NBD-FA和NBD-标记的配体相似的配体结合时的“开启”特性。在一些报道中，描述了关于BODIPY衍生物与牛血清白蛋白（BSA）的结合亲和性。Er et al.使用来自于Sudlow-site II标记产物库的一种BODIPY衍生物，发表了两种荧光染料的混合物用于HSA上双重药物靶点鉴定的文章，与布洛芬的竞争性实验证实了结合位点的特性。非常多的研究促使我们去设计和合成一个靶向Sudlow-site II的BODIPY衍生物5a-c文库。

首先，我们对这些化合物进行了无偏性的人血清白蛋白结合力测试。具有合适的荧光发射波长，饱和时展示出明确的1:1 HSA:BODIPY化学计量比的化合物进一步用于和布洛芬进行竞争性实验的研究。BODIPY衍生物5a最后被选为布洛芬的竞争性结合探针。

我们进一步希望使用第三个荧光配体，用于直接标记华法林结合位点 (Sudlow-site I)。华法林衍生物8a完全符合先前提到的标准。此外，它的荧光发射显著不同于NBD-FA和BODIPY 5a，因此在一种前所未有的三色光检测中，同步对三种配体进行选择性的定量应该是可以实现的（请见Figure 1)。

Figure1：华法林衍生物 8a（蓝色）、NBD-FA（绿色）和二甲氨基-博迪菲罗 5a（红色）的吸收光谱（已标准化）

由于我们是通过滴定实验确定了探针的KD值，我们决定通过不同的方法对这些结果进行独立的验证。为此，所有三种配体单独的特性检测由switchSENSE技术进行（Dynamic Biosensor，Munich）。这种荧光为基础的生物传感器能够检测生物分子的生物物理特性，通过荧光接近感应，确定结合和解离（Kon和koff)动力学以及解离常数（KD）。此外，switchSENSE在动力学模式下，通过检测表面连接的复合物的流体动力学摩擦系数，进而检测分子内产生的构象变化。本文中，switchSENSE技术不仅通过动力学常数以及结合平衡常数测定KD值，同时能够用于测量不同化合物和HSA结合后诱导产生的蛋白构象变化。

对于相互作用分析，HSA使用巯基偶联的化学法将短的，单链DNA纳米杆固定在金属芯片的表面。互补的DNA链，末端带有用于信号检测的荧光染料，通过Au-S键共价连到金属微电极表面。对于HSA和NBD-FA，二甲氨基BODIPY 5a和华法林衍生物 8a的相互作用，测得的KD值在微摩级(NBD-FA: KD = 27.5 µM, BODIPY 5a: KD = 5.2 µM, warfarin derivative 8a: K D = 25.5 µM)（请见Figure 2-5)。

Figure2：A) 利用switchSENSE技术对华法林衍生物 8a 进行动力学研究（接近式传感，n = 3，每个浓度的数据平均值，5 个浓度分别为 12.5 微摩尔至 200 微摩尔）。B) 在 200 微摩尔 8a 存在的情况下，对 HSA 的相对大小分析显示其流体动力学直径没有变化。

Figure 3：A) 利用switchSENSE技术对 BODIPY 类衍生物 5a 进行的动力学研究。B) 在 400 微摩尔 5a 存在的情况下，人血清白蛋白（HSA）的相对大小分析显示其流体动力学直径未发生显著变化。

Figure 4：A) 利用switchSENSE技术进行的NBD-FA动力学研究。B) 在400微摩尔NBD-FA存在的情况下，HSA 的相对大小分析显示其液流直径有轻微但显著的扩大。 

Figure 5：A) 利用switchSENSE技术对柳氮磺胺吡啶进行动力学研究。B) 在 20 微摩尔磺胺吡啶存在的情况下，人血清白蛋白（HSA）的相对大小分析未显示出流体动力学直径有显著变化。

在分子动力学模式，一旦NBD-FA结合，HSA展示了明显的舒展。由于在溶液中存在较高的流体动力学半径，HSA的分子动力随之降低。这种效应在BODIPY 5a和华法林衍生物 8a中都没有观测到。令人满意的是，这三种标签在所选的组合中表现良好，并且在每种情况下都允许在各自的结合位点上进行选择性竞争。Figures 6展示了典型的竞争性实验。在给定的浓度下，商业化的药物被加入到HSA与三色“鸡尾酒”混合液中。布洛芬，酪洛芬和消炎痛选择性的取代二甲氨基-BODIPY 5a，表明该探针选择性与白蛋白布洛芬结合位点结合（Sudlow-site II)。除了5a，消炎痛也取代华法林衍生物 8a。对于柳氮磺吡啶，一种用于治疗关节炎，溃疡性结肠炎以及克罗恩氏病的商业化药物，可使NBD-FA和coumarin 8a的荧光信号减少，表明这两种探针配体从蛋白上释放，而BODIPY 5a(Sudlow-site II)没有释放。

本文使用三色“鸡尾酒”混合染料，能够对HSA血清白蛋白的多个药物结合位点同时进行特异性研究，提高了对药物与蛋白互作检测的灵敏度和灵活性；同时，switchSENSE技术能够在检测不同的染料与HSA相互作用动力学的同时，也能观测到HSA的大小变化程度，为药物的作用机理提供了一种有价值的补充说明。