速通全长单细胞测序！I.DOT精准赋能 FLASH-seq，4.5 小时破解链入侵痛点

实验方法

核心平台与材料设计

采用384孔低吸附板（Eppendorf LoBind），选取HEK293T细胞、人外周血单个核细胞（hPBMCs）、18周人视网膜类器官为研究对象，以Superscript IV逆转录酶、KAPA HiFi聚合酶为核心酶试剂，设计三种实验方案：①FS（标准版，25 μL/5 μL反应体积）；②FS-LA（低扩增版，无中间清洁步骤）；③FS-UMI（含UMI与5 bp间隔子，减少链入侵）。主要检测指标包括基因检测数、比对效率、isoform鉴定效率、SNP检测灵敏度（Figure1a、1e、2a）。

图1. FS和FS低放大(FS-LA)协议概述。a，为本研究中使用的全长scRNA-seq协议处理96孔HEK293T细胞的估计协议持续时间。步骤用颜色编码。质量控制包括浓度和粒度分布测量。SSSC，SMART-SEQ单细胞套件(Takara)。b，在两个读取阈值下处理SS2(n=80)、SS3(n=51)和FS(n=105)处理的HEK293T细胞中检测到的基因数量，其中读取下采样到500,000(=500K)原始读取。c，平均值±标准差(S.D.)HEK293T细胞的基因体覆盖。d，在SS2(n=80)、SS3(n=51)和FS(n=105)中仅使用所有三种方法表达的基因(n基因=20,042)之间的Kendall‘s tau相关性。e，FS-LA工作流。所需的聚合酶链式反应周期数是细胞RNA含量的函数。f，使用250K下采样原始读取处理的HEK293T细胞中检测到的基因数量。基因检测阈值设置为>；0或>；5读数。g，顶部的面板显示了用FS或FS-LA处理的HEK293T细胞中映射到外显子(=CDS外显子)、内含子或基因间特征的阅读标签的百分比，使用ReSQC测量。底部面板显示了FS和FS-LA的映射统计信息以及唯一映射、多映射或未映射读取的百分比。h，平均值±S.D.HPBMC样本中每种细胞类型检测到的基因数(>；0读取)。仅显示两个或多个单元格支持的点。一些细胞没有足够的覆盖面，无法在每一个点上得到代表。在每种细胞类型的125K读数下，使用Wilcoxon秩和检验(双侧Bonferroni校正，调整P值)来评估FS和FS-LA中基因数量的差异。两组间差异无统计学意义(P>；0.05)。MAIT，粘膜相关不变T细胞；单核细胞；NK，自然杀伤细胞；Tcm，中央记忆T细胞；TEM，效应记忆T细胞；GDT，γ-增量T细胞；PDC，浆细胞样树突状细胞；cDC2，常规树突状细胞2。采用双侧Dunn‘s检验，并经Bonferroni校正，调整后的P值为b，d和f。f和g中的盒子图显示中位数(中心)，第25/75%百分位数(下/上铰链)，1.5×四分位数范围(胡须)和异常值(点)。。

02

关键操作与 I.DOT 的核心应用

裂解缓冲液分装：通过I.DOT将1μL裂解缓冲液（含Triton-X100、dNTPs、FS-dT30VN引物、RNA酶抑制剂等）精准分装至384孔板，密封后-20℃储存，保障每孔试剂浓度均一，避免交叉污染（对应文献Methods“Lysis buffer preparation”）。I.DOT的纳升级分配精度（±5%误差）是后续反应一致性的基础，尤其适配384孔板的高通量需求。

RT-PCR混合液添加：细胞分选后，从-80℃取出平板，经72℃孵育3分钟后冰浴，通过I.DOT向每孔添加4 μL RT-PCR混合液（含Superscript IV、KAPA HiFi ReadyMix、甜菜碱等），实现逆转录与cDNA预扩增“一步法”（Figure1e FS-LA workflow）。I.DOT的自动化添加避免手动操作误差，提升实验重复性，且支持1-384孔灵活适配，契合高通量测序需求。

三种版本实验流程：①FS：RT-PCR后经磁珠清洁、QC、标签化；②FS-LA：RT-PCR后直接取1μL cDNA进行标签化，无清洁步骤；③FS-UMI：RT-PCR混合液中加入含UMI和间隔子的TSO，减少链入侵（Figure2a）。

图2. 在FS-UMI中，链入侵事件得到缓解。a，链切换反应发生在cDNA末端(上)；当UMI和核苷序列相邻时(中)，链入侵事件增加，但被间隔区序列减轻(下)。b，使用UMI在HEK293T细胞中检测到的基因数量与几个下采样测序深度(NSS3=85，NSS3_Hagemann-J)的内部读数之间的关系。=101、NFS-CTAAC_STRT-DT=76、NFS-CAGCA_STRT-DT=16)。蓝线表示FS中检测到的平均基因数(μL=85，75K读数)。紫色/粉红色线条表示在SS3中检测到的基因的平均数量(Hagemann-Jensen等人5，UMI=粉色，INTERNAL=紫色，75K读数)。比较两种读数类型(双侧Wilcoxon秩和检验，Bonferroni调整P值，按读数类型着色)5和其他条件下在75K读数时检测到的基因数量。c，使用500K随机选择的UMI(HEK293T)，在读出开始附近的6-碱基对中的核苷酸分布。d，均值±S.D.去重复的UMI读数(%)包含UMI与上游序列之间的匹配，在20个碱基对内，有0到3个连续的5‘不匹配(NSS3=2,089,581，NSS3_Hagemann-J)。=13,511,157，NFS-UMI-TSO_STRT-dt=1,404,599，NFS-CTAAC_STRT-dt=9,964,516，NFS-CAGCA_STRT-dt=1,189,676，UMI读取)。e，通过寡聚-DT/TSO组合着色。视网膜器质与实验设计。视网膜和非视网膜部分突出显示。f，使用10x基因组学和FS-UMI(UMI，内部或两者同时读取)在典型细胞类型中检测到(>；0读取)基因。Dunn‘s检验(双侧，Bonferroni调整P值)。双极开，开中心双极电池；双极关，偏离中心的双极电池。g、基因多样性。通过对每种细胞类型的10个细胞重新采样100次，并计算在两个以上细胞中使用>；0读取(包括UMI/内部读取)表达的基因的数量。h，平均值±S.D.在不同的下采样读取深度检测到SNPs(nsf_retinalods=1,281)。对于每个细胞，转录区域的外显子组SNPs测序(测序深度(=dp)和gt；2)作为参考。在FS-UMI(绿色，DP&>2)或参考(粉色)中检测到的SNPs总数。在FS-UMI和参照物(橙色，DP>；2；紫色，DP>；2和变异质量(=QUAL)>；20)中检测到真阳性SNPs。假阴性SNP，FS-UMI中未检测到参考SNP(深绿色)。假阳性SNPs，在FS-UMI中检测到，但在参考文献中不存在(黄色，DP>；2；Brown，DP>；2&QUAL>；20)。真阳性SNPs(%)，在参考SNPs中检测到的真阳性SNPs的百分比。f和g中的框图显示了中位数(中心)、25%/75%(下/上铰链)、1.5×四分位数范围和异常值(点)。

检测与分析：测序采用Illumina NextSeq 550，数据经STAR比对、featureCounts计数、Seurat聚类分析，评估基因检测数、isoform多样性、SNP检出率（Figure1f-h、2f-h）。

实验结果

速度与灵敏度双突破，远超传统方法

FLASH-seq全程仅需4.5小时，比Smart-seq3短2-3.5小时（图1a），且在HEK293T细胞中检测到的基因数显著高于Smart-seq2和Smart-seq3（图1b），即使测序深度降低至500K raw reads，仍能捕获更多蛋白编码基因和长链基因。FS-LA版本省去中间清洁与QC步骤，上手时间<1小时，且HEK293T细胞10-12个PCR循环即可获得高质量文库，hPBMCs仅需14-16个循环（图1f-g），灵敏度与标准FS相当。

迷你化与自动化适配，I.DOT 助力高通量精准反应

将FS反应体积从25 μL迷你至5 μL后，HEK293T细胞基因检测数无下降，hPBMCs中CD14⁺单核细胞、naïve CD8⁺T细胞的基因检测数反而显著提升。这一迷你化成功得益于I.DOT的纳升级精准分配——384孔板中每孔裂解缓冲液与RT-PCR混合液的体积变异系数<3%，避免了手动分装的误差，为自动化高通量测序提供了技术支撑。

FS-UMI减少链入侵，提升isoform与SNP检测能力

FS-UMI通过在TSO中加入8nt UMI和5 bp间隔子，显著降低链入侵artifacts：与Smart-seq3相比，其UMIreads中“GGG” motif邻近比例下降，上游序列匹配率从>10.9%降至<4.25%（图2c-d）。在250K raw reads下，FS-UMI比Smart-seq3多检测8±4.3%的基因和18±6.1%的isoform（图2b），且能在视网膜类器官中检测到4.1±2.9倍更多的细胞类型标记基因（图2f）。此外，FS-UMI还能在单细胞水平捕获SNP，在视网膜类器官中61.57±1.7%的外显子SNP可被验证（图2h）。

多场景应用验证，适配稀有细胞与复杂样本

在hPBMCs中，FS成功重构TCR重排，稀有细胞（如MAIT细胞、pDC细胞）的基因检测数与主要细胞类型相当（SupplementaryFig.3a）；在18周视网膜类器官中，FS-UMI比10x Genomics检测到更多基因和更高基因多样性（图2f-g），精准注释出OFF-center双极细胞（GRIK1⁺）、无长突细胞前体（PTF1A⁺）等稀有细胞类型，还能区分PKM1/PKM2两种剪接异构体，而10x Genomics无法区分该isoform。

总结与讨论

本研究开发的FLASH-seq技术，以“快速、高敏、低artifact”重塑全长scRNA-seq范式，而I.DOT非接触式纳升级移液系统是其实现高通量、自动化、迷你化的关键支撑——通过纳升级精准分装裂解缓冲液与RT-PCR混合液，解决了微量反应中体积不均一、交叉污染的痛点，使384孔板高通量测序成为可能，大幅降低实验成本与上手难度。

技术突破体现在三方面：①速度革新：4.5小时完成文库构建，FS-LA版本上手时间<1小时，远超Smart-seq3；②artifact抑制：FS-UMI的间隔子设计减少链入侵，提升isoform与SNP检测准确性；③灵活适配：迷你化至5μl仍保持高灵敏度，兼容hPBMCs、视网膜类器官等复杂样本，尤其适合稀有细胞分析。

与传统方法相比，FLASH-seq兼具全长覆盖优势与droplet方法的高通量潜力，成本<1美元/细胞，且I.DOT的自动化适配使其易整合到实验室现有高通量平台。未来可进一步拓展至临床样本快速检测、单细胞多组学联合分析等场景，而I.DOT等精准分配技术的应用，也为测序技术的迷你化、自动化发展提供了可复用范式，推动全长scRNA-seq从基础研究走向临床转化。

参考文献

1、Hahaut V, Pavlinic D, Carbone W, Schuierer S, Balmer P, Quinodoz M, Renner M, Roma G, Cowan CS, Picelli S. Fast and highly sensitive full-length single-cell RNA sequencing using FLASH-seq. Nat Biotechnol. 2022 Oct;40(10):1447-1451.