RNA结合蛋白与RNA的相互作用，对于研究细胞内基因调控机制不可或缺。结构学能够在原子水平上研究分子间的相互作用，而与此互补的方法，比如表面等离子共振（SPR）和等温滴定量热法（ITC）能够用于定量分子互作的亲和性以及评估点突变对这些互作带来的影响。
switchSENSE是一种可以用于测量蛋白与不同种类分子（DNA,蛋白/肽或小分子）间互作的新兴技术。在本文的研究中，我们证明了该技术可用于灵活且精确的研究RNA结合蛋白（RBPs)。我们成功地测量出三种RNA结合蛋白（Fox-1, SRSF1和Tra2-β1）与其对应的RNA结合序列之间的互作状态，并获得与SPR或ITC测量结果较为接近的KD值。研究结果表明，switchSENSE技术可作为一种替代的方法，研究蛋白-RNA之间的相互作用，可测得的KD值范围在uM(10-6 ) 到nM(10 -7 to 10-9 ) ,甚至可达到pM（ (10 -10 to 10-12 )范围。底物分子无需进行标记以及低的样本消耗（蛋白和RNA）使switchSENSE技术较其他技术具有一定的优势。
RNA是一种多功能分子，除了作为DNA和蛋白之间的连接桥梁，在基因表达方面也发挥着多种关键的作用。作为一种短链分子（例如miRNA, piRNA, siRNA, snoRNA或snRNA），它能够形成RNA-RNA双螺旋，涉及到转录后调节过程；作为一种相对更长的分子，RNA能够形成不同的二级或三级结构，具有酶性质的催化活性（例如核糖酶）或招募RNA结合蛋白到其发挥功能的细胞区域。最后，RNA分子通常受到转录后的修饰（例如假尿嘧啶化，2 ' - o -甲基化或碱基编辑），这使得对其活性的调节变得更加复杂。
蛋白质与 RNA 的相互作用在很大程度上被用于调控几乎所有与基因表达相关的关键细胞机制（例如转录调节，转录后基因沉默或表观修饰），这也解释了为什么破坏蛋白与其靶向RNA结合常导致细胞通路的错误调控，造成疾病的发生。为了更好的理解基因表达调节机制，需要研究蛋白-RNA复合物，发现新的疾病治疗策略。因此开发新的技术用于剖析分子间相互作用就显得十分重要。
对蛋白-RNA复合物的结构分析一般是用于在RBPs行为模式的原子水平上进行解析，作为对结构分析的一种补充，其他的方法，例如ITC或SPR，常用于解析RNA或蛋白分子的突变对于复合物之间亲和性的影响，并鉴定对复合物形成最重要的接触位点。近来，Dynamic Biosensor(DBS，Germany)公司开发了一种称为switchSENSE的技术，利用生物芯片，可将DNA或感兴趣的蛋白固定在该芯片上，用于快速的检测蛋白-DNA，蛋白-蛋白和蛋白-小分子之间的亲和性和动力学（KD，Kon和Koff)。
switchSENSE技术的原理是金属微电极上短链DNA受变换的电压驱动下的可控性摆动。根据施加于电极上的电压，DNA链被排斥远离金属表面或被吸引靠近金属表面。可通过共价连接在DNA分子末端的荧光分子的荧光变化实时监测DNA的运动过程。与锚定链互补的 DNA 链可以通过一种配体分子进行功能化处理，这种配体分子理论上可以是任何能够通过常规化学和生物化学方法进行连接的分子。此外，第二条链本身也能够作为相互作用分析实验的靶点，这使得能够使用各种各样的核酸结构进行实验。例如，本研究中，一条单链RNA分子与锚定链杂交，并且以短的突出的单链末端作为蛋白结合研究的靶点。
由于DNA纳米杆的摆动发生在水相环境（缓冲液）中，动力学摩擦系数是影响摆动速度的关键性参数。配体分子与纳米杆共价结合将会增加额外的流体阻力，导致摆动速度减小。底物分子与固定配体的结合将进一步减小摆动速度。这种摆动动力学的改变可实时监测，使得能够通过分析结合动力学研究分子相互作用。并且，纳米杆运动速度减小的程度与附着分子的大小相关（大分子产生的流体摩擦力比小分子更大）。这种效应可用于测量与纳米杆结合的蛋白的流体动力学直径以及配体/底物复合物的直径。
switchSENSE技术特别适用于研究RNA结合蛋白，因为感兴趣的RNA能够被转录并与生物芯片上附着的单链DNA（ssDNA）进行杂交。对于该研究，我们使用长的RNA序列（大约60nts)，该序列的3’端能够完全与结合在电极上的含有48个碱基的单链DNA进行互补配对，5' 部分对应的是一个侧翼的非杂合序列，该序列包含一个由 4 个尿嘧啶组成的连接子、与蛋白质结合的基序以及 GAG 转录起始基序（请见Fig. 1A)。利用 T7 RNA 聚合酶在体外成功实现了 RNA 的高效转录，并且经HPLC纯化。我们接下来必须检测这种纯化的RNA是否能够有效的和芯片上的ssDNA进行互补配对。一旦RNA-DNA复合物形成，便可通过荧光信号的增加检测RNA的杂交状态（请见Fig. 1B). 这种检测基于当对电极施加负压时，杂交双链相较于非杂交的单链DNA更容易被排斥远离电极（请见Fig. 1B). 我们测试了不同的 RNA 浓度，并观察到在水或 T40 缓冲液中，当 RNA 浓度为 1 微摩尔时，与单链 DNA 的杂交过程是高效且可重复的（请见Fig. 1B)。我们也观察到当杂交温度达到37°C时可增加DNA-RNA双链的形成，可能是因为该温度限制了RNA二级结构的形成。我们也检测了使用Dynamic Biosensors提供的再生缓冲液进行再生步骤后，杂交的RNA分子能够完全从电极上去除。
Fig. 1 switchSENSE技术检测蛋白-RNA相互作用示意图
我们接着测量结合到感兴趣的ssRNA序列侧翼上的蛋白是否能够通过switchSENSE技术被检测到（请见Fig. 1)。我们决定采用RNA识别基序（RRMs），因为他们能够在广泛的亲和性范围内与ssRNA发生互作（KD值从uM到nM范围）。我们首先测量了Fox-1 RRM, SPR结果已经证明它可以结合到RNA的 5’-UGCAUGU-3’ 序列，KD值为1.09nM。根据该信息，我们转录并纯化了在5’端非杂交部分包含该序列的RNA分子（请见Fig. 1A），并且通过Dynamic Biosensors的switchBUILD软件预测了实验条件。当感兴趣的蛋白-RNA复合物没有相应的KD值的信息时，实验人员首先需要逐渐增加蛋白浓度，直到观察到动力学应答荧光信号的改变。估测值通常比能够观测到蛋白与RNA结合所需的最小浓度值高10倍左右。使用这个估测的KD值，switchBUILD能够自动计算用于动力学测量的蛋白浓度和体积，并调节最适流速和结合/解离的时间。通常情况下，该软件会为待测底物设定一个浓度范围，使得在与配体结合后的五分钟内，其信号会有显著变化。此外，switchBUILD 允许用户手动调整所有实验参数。软件生成的脚本能够直接在switchCONTROL软件中打开，该软件控制着设备。对于动力学测量，我们推荐在每一个解离步骤后移除并杂交新鲜的RNA分子，确保在开始一个新的蛋白结合步骤前，所有结合的蛋白都完全被移除。该蛋白质与目标 RNA 的结合以及随后的解离过程，通常通过使用不同的蛋白质浓度来进行测定，以获得准确且可重复的 k(on)、k(off) 和 K(D) 值。
switchSENSE技术的优势之一是可以通过两种独立的方法获取动力学参数。一个是通过与电极结合的ssDNA 3’端的荧光分子（请见Fig. 1A)。一旦蛋白与杂交的RNA分子结合，荧光信号发生淬灭或增加，在蛋白结合和解离期间能够实时检测荧光信号变化。这种方法特别适用于研究两个大小差异较大的分子间的相互作用（例如蛋白和小分子的互作）。同时，一旦蛋白发生结合和解离，能够通过检测DNA-RNA复合物的摆动速度获取动力学参数（请见Fig. 1C)。蛋白和RNA结合增加了流体动力学摩擦，降低了复合物的运动速度，解离效应与此相反（请见Fig. 1D)。为了确定 DNA 的摆动速度，会持续从对 DNA 运动的观察中提取动态响应（DR）值，并随时间进行跟踪（请见Fig. 1C和D）。虽然在本研究中，我们观测到的信号改变不足以决定三种蛋白-RNA复合物的动力学参数，但是我们通过追踪蛋白结合和解离后DNA-RNA复合物的运动速度获取了高重复性的KD值。因此，这两种方法根据研究的需要和相互作用性质是互补的。
在本次研究中，我们重点研究三种基于其与 RNA 的亲和力差异而形成的蛋白质-RNA 复合物：Fox-1 RRM（KD = 1.09 nM）、SRSF1 RRM2（KD = 0.8 µM）以及 Tra2-β1 RRM（KD = 2.25 µM）。Fox-1 RRM的亲和力先前已由SPR测定，我们首选需要检测是否switchSENSE能够测得相似的KD值。我们使用6种不同的蛋白浓度，并且使用全局单指数拟合模型分析数据（请见Fig. 2A)。我们得到的KD值为1.49nM，与SPR数据有较好的一致性，但Kon和Koff的数值是不同的，由于在分析数据中使用了不同的拟合模型，使得对速率常数直接进行比较变得复杂：SPR 数据并非遵循简单的指数时间变化规律，而是需要采用一种复杂的质量运输限制拟合模型来加以描述，该模型包含了用于补偿不完全解离的偏移项；而switchSENSE技术能够使用简单的单指数模型进行数据拟合，符合1:1的相互作用预期结果。我们通过研究Fox-1 RRM与polyU的结合，也证明了这种相互作用是特异的。如Figure 2B所示，在测试的所有蛋白质浓度条件下，均未检测到相互作用。我们接下来测试switchSENSE技术是否可用于检测野生型Fox-1 RRM和涉及RNA结合残基发生突变的蛋白之间亲和性的微小差异。我们测试了Fox-1 RRM F126H的动力学，其经SPR检测（KD值为22.1nM），switchSENSE测得相似的KD值（25.3 nM)（请见Fig. 2C）。
在另一项研究中，我们甚至能够可靠性的检测到野生型和Fox-1突变型蛋白之间2到5倍的亲和性差异（突变蛋白分别为Fox-1 S122A和S155A）。最后，我们测试使用DBS提供的试剂盒将Fox-1 RRM直接偶联到生物芯片上的可能性，该试剂盒能够使半胱氨酸连接到与纳米杆互补的ssDNA上。由于在Fox-1 RRM的序列中不存在半胱氨酸，我们对166位的丝氨酸进行了改造，该氨基酸不涉及RNA的结合并且是可溶性暴露的。在这种情况下，我们并未发现当固定化的结合物与 RNA 进行孵育时，其动态反应有显著变化。然而，当 RNA 结合时，荧光信号明显增强（请见Fig. 2D)，其KD值与Fig. 2A中测得的值非常接近（分别是4.39nM和1.49nM）。但两个实验中所获得的Kon和Koff值是存在微小的差异的，这种差异似乎源于蛋白的固定。
Fig. 2 switchSENSE技术检测Fox-1 RRM和RNA的相互作用
我们接着测试switchSENSE是否可适用于更高的KD值检测。我们测量了SRSF1 RRM2-RNA复合物的相互作用，该蛋白的一个结构域通过非经典的识别模式与5’-GGA-3’ RNA基序发生互作，在 5’-UGAAGGAC-3’RNA存在下，ITC测得的KD值为0.8uM。
在本研究中，我们分别测量不同的蛋白浓度，并且所有浓度下的数据都呈现较好的全局拟合。我们测得的KD值比预期的值略低（0.39uM)(请见Fig. 3A)。与Fox-1 RRM相似，阴性对照中未检测到相互作用（请见Fig. 3B)。
Fig. 3 switchSENSE技术检测SRSF1 RR2和RNA的相互作用
最后，我们测试在更广的uM范围内，switchSENCE是否能够检测蛋白-RNA的相互作用。我们重点研究了 Tra2-β1 RRM 这一蛋白，此前我们已解析了其与 5’-AAGAAC-3’ RNA 结合后的结构，并通过 ITC 测定出其 KD 值为 2.25uM。如Fig. 4A所示，即使在该亲和范围下，我们也能够在6种不同的蛋白浓度下获得全局性的数据拟合，其KD值为2.89uM。这些蛋白浓度下，未发现与polyU RNA的相互作用（请见Fig. 4B)。最后，我们采用了另一种方法来确定该复合物的 KD 值，即通过报告不同蛋白质浓度下在每次结合步骤结束时测量的 DR 值来实现。这一滴定实验生成了一张曲线图，该曲线图可以使用朗缪尔方程进行拟合。我们得到了一个 KD 值为 1.53 µM（请见Fig. 4C），与通过动力学分析得出的值相近(请见Fig. 4A)。
Fig. 4 switchSENSE技术检测Tra2-β1 RRM和RNA的相互作用
