传统非病毒转染效率低，而筛选增强剂需测试数千种化合物，依赖微孔板的高通量技术存在试剂消耗大（每实验需20 μL）、成本高的瓶颈。德国卡尔斯鲁厄理工学院团队开发的液滴微阵列（DMA）平台，结合I.DOT非接触式纳升级移液系统，首次实现20 nL级微量体系的高通量转染筛选：单次筛选774种药物，完成41796次实验仅消耗0.84 mL细胞悬液和0.02 μmol药物，试剂用量较384孔板减少2500倍，成功筛选出14种转染增强剂，转染效率提升2-5倍，为基因递送研究和生物制药生产提供突破性工具
采用7.5×2.5cm玻璃载玻片，表面图案化为超疏水背景包围的亲水斑点（500 μm或1 mm边长），形成588或2187个独立反应单元，每个单元可容纳20-100 nL液滴（图1A）。
图1. A）具有588个单独微滴的1 mm（正方形边长为1 mm）微滴微阵列（DMA）的代表性图像。DMA载玻片的尺寸为7.5 ± 2.5 cm。B）明视野显微镜图像，显示孵育24小时后CHO-K1细胞的形态（比例尺：100 µm）。C）用GFP质粒DNA转染的HEK 293 T细胞在具有Imm斑点尺寸的液滴微阵列上的代表性图像（比例尺：Imm）。用GFP质粒DNA转染的D）HEK 293 T细胞、E）CHO-K1细胞和F）Jurkat悬浮细胞的单个微滴的荧光显微镜图像（比例尺：100 µm）。
药物分配：通过I.DOT将774种FDA批准药物（1、10、30 μM三个浓度）以20 nL/spot分配至500 μmDMA，真空干燥去除DMSO（避免细胞毒性）[1]（图 2A）。
图2. 原代细胞筛选的工作流程。A）将774种FDA批准的药物作为DMSO溶液印刷在500 μmDMA载玻片上，并在真空干燥器中干燥过夜。然后将与转染混合物（ScreenFectA转染试剂，GFP质粒DNA）混合的细胞印刷到每个斑点中，并与药物孵育24小时，然后固定和荧光显微镜分析。药物的最终浓度分别为1、10和30×10−6m。将初筛的14种命中化合物打印到1mm DMA载玻片上，并以相同的方式重复该过程，除了使用更大的浓度范围：1、5、10、20、30和40×10−6m。对于无药物对照实验，将转染混合物打印到空点中。B）设计用于转染增强剂筛选的高通量筛选方法。在500 µmDMA载玻片（每次实验20 nL）上进行初步筛选，在1mm DMA载玻片（每次实验100 nL）上进行二次筛选。在常规高通量筛选平台384孔板中进行进一步验证和比较。最后，在优化条件下在96孔板中确认命中。C）筛选了774种FDA批准的药物，共进行了41796次单独实验。各个水性隔室的体积为20 nL，其总共产生仅0.84 mL的总细胞悬浮液，并且仅需要200皮摩尔的药物（总共0.02摩尔），这比必须在384孔板中进行相同实验的情况小2500倍。
细胞与转染复合物分配：I.DOT将含GFP质粒和转染试剂（ScreenFectA）的CHO-K1、Jurkat、HEK293T细胞悬液以20 nL/spot分配至药物预处理的DMA，湿度控制在70%以防止蒸发（图 1B-D）。
检测与量化：24小时后固定细胞，通过荧光显微镜计数GFP阳性细胞（转染效率）、Hoechst染色（总细胞）、PI染色（死细胞）（图1C）。
CHO-K1 细胞（难转染）：以GFP阳性细胞数量为指标，初筛结果显示药物对转染效率的影响具有浓度依赖性（图3A）。在1 μM浓度下，425种药物表现出转染增强效应，349种抑制；10 μM时，624种增强（数量最多），150种抑制；30 μM时，236种增强，538种抑制。这可能与药物对细胞内吞、转染复合物运输及定位的影响差异有关。通过“对照组均值+3倍标准差”阈值，初筛获得19个（1 μM）、78个（10 μM）和18个（30 μM）候选化合物（图4），其中7种（如金诺芬、卡托普利等）在不同浓度下均表现出稳定增强效果。
图3. FDA批准的药物对CHO-K1细胞转染效率的影响。A）使用来自20898次总转染实验（三次生物重复和每次三次重复）的量化的相对转染效率数据产生的热图。蓝色和红色分别表示与不添加药物的对照相比，效率的降低或增加。使用了三种不同的药物浓度：1、10和30×10−6m。B）使用主成分分析（PCA）评分图的初步筛选结果的概述。每个数字代表FDA批准的药物库中的一种药物。
图4. 在CHO-K1细胞的初步筛选中鉴定为转染增强剂的命中化合物。A）774种FDA批准的药物中的19种是从1×10-6 μM浓度的CHO-K1细胞的初步筛选中获得的。B）在10×10−6m浓度下鉴定出78种命中化合物。C）在30×10-6 μmCHO-K1细胞处初步筛选获得的18种命中化合物的散点图。红色表示化合物（金诺芬、卡托普利、半硫酸反苯环丙胺、吡罗昔康、卡比多巴、苯唑西林钠盐一水合物和硝酸奥昔康唑）在不同浓度下显示可重复的正增强作用，绿色表示化合物（利福平、酒石酸卡巴拉汀、醋酸氢化可的松、异环磷酰胺、吲达帕胺、甲泼尼龙和盐酸萘唑啉）在一个浓度下显示强增强作用。数据表示为三次生物学实验的平均值±SD，每次三次技术重复。
Jurkat 细胞（悬浮细胞，转染难度高）：初筛中阳性结果显著少于CHO-K1细胞。1 μM时244种药物增强，530种抑制；10 μM时325种增强，449种抑制；30 μM时192种增强，582种抑制。仅在10 μM和30 μM时各筛选出2个和1个候选化合物，且因细胞本身转染效率极低，增强倍数仅为6-8倍（相对值）
可靠性验证：通过主成分分析（PCA）对初筛结果进行验证，显示候选化合物与对照组差异显著，与初筛算法结果一致（图3B），排除了假阳性信号。
从初筛中选取14种增强效果显著或稳定的化合物（如氢可的松acetate、异环磷酰胺等），在1mmDMA平台上开展浓度梯度（1-40μM）验证（图2B），并引入HEK293T细胞（易转染）作为对照；转染效率方面，14种化合物均表现出剂量依赖性，转染效率较对照组提升1.8-5.1倍（图5）。其中，吡罗昔康和反苯环丙胺半硫酸盐在高浓度（30-40μM）下仍保持增强效果，而其余12种因细胞毒性在高浓度时效率下降。
图5.14种命中化合物对GFP质粒DNA转染CHO-K1细胞的影响。将不同量的14种命中化合物（金诺芬、卡比多巴、卡托普利、醋酸氢化可的松、异环磷酰胺、吲达帕胺、苯唑西林钠盐一水合物、甲泼尼龙、盐酸萘甲唑啉、利福平、硝酸奥昔康唑、吡罗昔康、反苯环丙胺半硫酸盐和酒石酸卡巴拉汀）印刷到1mmDMA上，在真空中干燥。
细胞活力：14种化合物均随浓度升高导致细胞活力下降（PI染色检测），提示转染增强效果需平衡药物毒性。
HEK293T细胞验证：与CHO-K1趋势一致，转染效率提升1.2-3.5倍，进一步支持候选化合物的通用性；而Jurkat细胞未观察到显著增强，可能与其本身转染障碍相关。
384孔板验证：CHO-K1细胞在最佳浓度下的转染效率与1mm DMA结果趋势一致（图6），尽管384孔板中单个反应的细胞数量更多（1135个/孔vs100个/斑点），但平均效率无显著差异，证明DMA结果可迁移至传统平台。
图6. 在最佳浓度下，在A）1mm DMA和B）CHO-K1细胞的384孔板上的单个斑点中，两种形式的所有三个分析重复中，来自初步筛选的命中化合物的影响。单独显示了每个拍摄的图像/每个孔（每个斑点）中的转染效率。不同的形状表示单个重复（重复1-正方形，重复2-圆形和重复3-三角形）。根据二次筛选，每种药物的最佳工作浓度用于每种药物（表S2，支持性信息）。用在10μLScreenFect稀释缓冲液中的0.017 μLScreenFectA制备转染复合物，随后将在稀释缓冲液中的总共17ngGFP质粒DNA稀释至10 μL的最终体积（ScreenFectA与质粒DNA的比例为1：1）。然后将浓度为7.13×104个细胞mL-1的80 µL新鲜细胞悬液加入复合物中，然后混合并以20 µL/孔的体积接种到每个孔中。数据表示为三次生物学实验的平均值±SD，每次三次技术重复。
96孔板优化验证：选取4种化合物（氢可的松acetate、萘甲唑啉・HCl等），在优化转染参数（0.4 μL转染试剂+100 ngDNA/孔）后，转染效率从对照组的30.3%提升至33.9%-38.8%，进一步确认了其增强效果。
该研究证明DMA平台在超微量高通量筛选中的巨大潜力：仅用0.84 mL细胞悬液和0.02μmol药物完成4万余次实验，成本降低2500倍。14种阳性化合物（如金诺芬、卡比多巴等）可将转染效率提升至5倍，为基因治疗载体优化与蛋白生产提供新工具。
I.DOT非接触分配技术在微量液滴精准操控中的应用，解决了传统打印的蒸发与污染问题，推动DMA成为细胞生物学与药物筛选的革新性平台。未来该技术有望拓展至更多高通量场景，加速生物活性分子的发现进程。
