传统药物开发中，化合物库合成与生物筛选面临“高成本、低通量、长周期”的三重挑战，单药研发成本超20亿美元，且96孔板等传统平台难以满足微量样本的高效利用需求[1,2]。德国卡尔斯鲁厄理工学院团队联合I.DOT非接触式液滴分配技术，推出光控释放液滴微阵列（DMA）平台，首次实现从纳摩尔级固相合成到活细胞筛选的全流程集成。该平台通过I.DOT精准操控100nL级液滴反应单元，结合UV触发化合物释放机制，将试剂消耗降低至传统方法的1/1000，为高通量药物发现开辟全新路径。
纳米多孔聚合物涂层：在玻璃基底制备12µm厚HEMA-EDMA聚合物层，通过硫醇-炔点击化学构建亲水（接触角4.4°）/超疏水（接触角170°）图案，形成3mm圆形（5µL）或1mm方形（100nL）液滴阵列（图1）。I.DOT技术通过气压脉冲（75-300mbar・ms）实现非接触式液滴生成，体积误差<1%，单细胞接种成功率>95%。
图1. 液滴微阵列平台结合高通量固相合成和基于细胞的筛选。A）多孔聚甲基丙烯酸酯薄膜（12 μm）用氟烷基和半胱胺部分官能化以分别产生SH和反应性HL区域。UV-可切割的连接体（羟乙基光连接体，HEPL）共价固定在HL斑点中，形成后续固相组合合成的基础。B）显示可能的基于细胞的筛选顺序的方案：合成的化合物可以通过在365 nm下的UV照射ii）释放到在HL斑点中形成的不同纳米液滴中，以在生物测定（i）中筛选或分析，例如，通过MALDI-TOF质谱法（iv），随后进行纯化步骤
UV 可裂解连接剂锚定：将羟基乙基光连接剂（HEPL）通过酯键固定于亲水斑点，其硝基基团在 365 nm UV 光下可快速还原为亚硝基，释放共价结合的化合物（图2）。
图2. A）将CHL附着到HEPL上，随后在UV-照射下释放，在表面上留下裂解的光致连接物（c-HEPL）。B）通过对不同照射时间后的溶液进行光谱分析，确定了作为模型药物的CHL从表面释放到5µL液滴中的UV触发动力学。每个数据点是三次实验的平均值。误差线表示标准差。C）通过UV光对HEPL裂解的空间控制。在接头裂解期间，显黄色。制备液滴微阵列，并在通过光掩模照射之前在所有HL斑点中用HEPL修饰。顶部图案：2688个正方形斑点，边长500 µm，边框250 µm。使用“KIT Levkin Lab”徽标作为倒置光掩模。底部图案：以棋盘图案照射80个直径为3 mm的圆点。UV连接体HEPL可完全控制化合物的空间释放。
组合化学高通量合成：利用I.DOT的高通量分配能力，在1 mm方形斑点中依次分配30 nL胺溶液、35 nL羧酸溶液和40 nL异氰化物溶液（0.5MGBL体系），通过非接触式打印避免交叉污染。5种表面锚定氨基酸、3种异氰化物、7种羧酸和8种羰基化合物组合，理论生成840种双酰胺产物（图3）。
图3. Ugi四组分反应的示意图，具有表面锚定的胺（1-5）、羧酸（9-15）、醛或酮（16-23）和异氰化物（6-8）以及形成的双酰胺（产物24-36）的可变条目。底部：固相化学的详细表示。连接到聚合物层的每个4-戊炔酸充当分支点并带有两个连接分子，有效地使反应位点的总数加倍。
自动化流程整合：I.DOT与MALDI-TOF联用，通过三明治转移技术将液滴产物复制到ITO玻片，实现高通量质谱表征（图4）。
图4.将微滴微阵列复制到ITO载玻片上用于MALDI-TOFMS测量的过程。A）定位装置有助于将两个载玻片彼此对准。左侧是具有经照射的液滴微阵列的底部部分，而右侧是具有ITO载玻片（已经压印有基质）的顶部部分。B）封闭式密封装置。两侧的两个连接器将两半拉在一起，而距离由四个螺钉控制。降低顶部，直到所有液滴接触ITO载玻片。C）干燥DMA（14×141 mm HL点，顶部）、每个点中具有100 nL水的DMA（中间）和UV照射后的干燥阵列（底部）的合并照片。D）复制液滴中含有基质混合物（CHCA/DHB）的液滴微阵列并真空干燥后的ITO载玻片。E）作为钠加合物的化合物37的MALDI-TOF光谱（[M+Na]+，检测：717.55m/z，计算：717.38u）和F）基质背景。首先通过UV照射将化合物切割成不同的液滴，然后向每个斑点中加入100 nL CHCA和DHB基质在10% ACN/水（含有5×10−3M HCl）中的饱和溶液，并将DMA载玻片固定在ITO载玻片上以复制阵列。将ITO载玻片真空干燥并通过MALDI-MS分析。
I.DOT 细胞接种与活性检测：以氯ambucil（CHL）为模型药，I.DOT将CHO-K1细胞（1×10⁵cells/mL）精准接种至DMA斑点，UV照射（2.5 mW/cm²，15 min）触发CHL释放，通过Calcein-AM/PI染色评估细胞活力。
图5. 将CHO-K1细胞接种在DMA上，并在孵育24小时后，通过钙黄绿素AM/PI染色不同处理的表面来测定其活力。活力不受紫外光或固定化CHL的存在下。细胞活力仅在用附着的CHL照射表面后降低，这导致药物释放到液滴中。每个柱代表同一实验重复三次的平均值。误差线表示标准差。
时空精准调控：I.DOT配合光掩模实现区域选择性释放，如“KIT” logo图案化释放验证空间控制精度（图2C）；CHL释放动力学显示，15分钟内可达最大浓度954 µM（图2B），满足细胞筛选的剂量需求。
细胞水平验证：UV触发CHL释放后，CHO-K1细胞存活率从97%降至3%，而未照射组或无药组存活率无显著变化，证明I.DOT构建的微环境可精准模拟药物-细胞互作。
微型化优势：1 mm方形斑点较3 mm圆形斑点，单位面积反应密度提升7.5倍（30spots/cm²），单玻片可构建588种化合物库，较96孔板通量提升6倍。I.DOT的非接触式分配使试剂消耗从20 µL/样本降至100nL/样本，成本降低99%。
产物多样性与纯度：13种代表性产物纯度21%-91%（LC-MS分析），MALDI-TOF验证显示I.DOT辅助合成的化合物结构一致性达95%以上。
I.DOT驱动的技术革新展现出显著的核心技术价值，其非接触式分配与DMA光控释放结合，实现“合成-释放-筛选”全流程自动化闭环，较传统多平台操作减少7次样本转移，误差降低80%，且支持单日处理超1000样本，单细胞cDNA回收率达85%，平衡了高通量与低耗需求。在转化医学应用中，可用于肿瘤药敏个性化筛选，48小时内完成评估，周期缩短70%，还能精准控制信号分子浓度以维持胚胎干细胞多能性，未来将开发亚微米级斑点提升库容量至10⁴级，并集成微流控灌注系统模拟体内药代动力学。
1. J. A. DiMasi, H. G. Grabowski, R. W. Hansen, J. Health Econ. 2016, 47, 20.
2. H. E. Blackwell, Curr. Opin. Chem. Biol. 2006, 10, 203.
