在细胞生物学和药物研发中，传统研究流程需在微孔板、离心管、PCR板等多平台间转移样本，导致实验变异大（跨平台误差>20%）、核酸损失高（低细胞数样本回收率<50%）。例如，基因表达分析需多次转移样本，单细胞核酸损失率高达70%。本篇文章中德国卡尔斯鲁厄理工学院团队开发的“Cells-to-cDNAonChip”技术，通过液滴微阵列（DMA）平台与I.DOT非接触式纳升级分配技术的结合，首次实现从活细胞培养到cDNA合成的全流程纳升级集成，将试剂消耗降低至传统方法的1/100，操作时间缩短33%。该技术通过精准操控液滴微环境，同步实现表型分析与基因表达检测，为单细胞研究和高通量筛选提供了革命性工具。
亲水-超疏水图案化表面：DMA玻片通过硅烷化处理和硫醇-炔点击化学，形成1mm²亲水斑点（接触角<10°）与超疏水边界（接触角>150°），自发稳定纳升液滴（图1）。
图1. “芯片上细胞至cDNA”方法的示意图。1=在DMA上以微/纳升液滴进行细胞培养和筛选，2=通过基于显微镜的方法进行细胞表型分析，3=使用聚T磁珠进行细胞裂解和mRNA分离，4=在同一液滴内将mRNA转化为cDNA，5=收集cDNA用于定性和定量基因表达分析。
I.DOT 非接触式分配技术：基于气压脉冲驱动（75-300 mbar・ms 可调），实现 200 nL 液滴的精准生成，体积误差 <1%，单细胞接种成功率> 95%[36,45]。此外，通过动态调节压力参数优化细胞存活，150mbar・ms压力下，HeLa细胞存活率较75mbar・ms提升42%，避免接触式移液的机械损伤[1]。
细胞培养与表型监测：通过I.DOT将1-1000个细胞/液滴接种至DMA亲水斑点，在湿度腔（37°C, 5%CO₂）中培养24-48小时。利用KeyenceBZ-9000显微镜实时捕获荧光信号（如GFP表达强度），量化表型变化（文献[1]）。
纳升级分子操作：液滴内裂解与mRNA捕获：I.DOT分配150nLRLT裂解缓冲液，结合poly-T磁珠（GEHealthcare）实现mRNA提取，洗脱效率达92%（传统试管法75%）。同时，在200nL体系中加入SuperscriptIV逆转录酶，通过湿度腔的热循环（65°C退火/52°C合成）完成cDNA合成，PCR扩增成功率100%[2,3]。
单细胞回收效率：单HeLa-GFP细胞的cDNA经qPCR检测，Ct值波动仅±1.5cycle，回收率达85%±3%，较传统试管法（50%±8%）提升70%[1]。
高通量一致性：672液滴同步处理不同浓度阿霉素，mRNA提取与cDNA合成的批次间变异系数<5%，IC₅₀值与传统384孔板吻合度>95%（图2）。
图2.在液滴微阵列上从总HeLa-CCL2RNA开始cDNA合成。A）DNA上cDNA合成的示意性方案。B、C）5μL和D、E）200nL液滴分别在3mm和1mmDMA亲水点上的双视野显微镜图像，B、D）在cDNA合成反应之前，C、E）在cDNA合成反应之后。比例尺=500μm。F）用从50ngHeLa-CCL2总RNA合成的cDNA进行的GAPDHPCR（产物大小=112bp）的凝胶电泳图像。[Lane编号1=1kbDNA梯状条带，2=无模板（阴性）对照，3=在微管中合成的cDNA的PCR产物（阳性对照），4=在3 mmDMA上合成的cDNA的PCR产物，体积为5 μL，5=在1 mmDMA上合成的cDNA的PCR产物，体积为200 nL]。G）用从50ngHeLa-CCL2总RNA合成的cDNA进行的ACTBPCR（产物大小=1045bp）的凝胶电泳图像。凝胶泳道中的样品序列与图2F相同。
交叉污染控制：在 3 mm DMA 平台的‘Cells-to-cDNA on Chip’流程中（图 3），I.DOT非接触式分配使跨液滴污染率<0.01%，显著低于接触式移液（1-5%）[3]。
图3. 液滴微阵列上的“芯片上细胞到cDNA”方法的详细示意性工作流程。RT =室温。
siRNA干扰效率：液滴内转染siGFP（100nM）48小时后，HeLa-GFP细胞荧光强度下降90%，qPCR显示GFP转录水平降低至88.7%±2.3%，与表型数据高度吻合（图4）。
图4. 在3mmDMA上用“Cellsto-cDNAonChip”方法对不同细胞数和siRNA介导的靶基因敲除进行定性分析和基因表达定量。A、B）分别为GAPDH（产物大小=112bp）和ACTB（产物大小=1045bp）PCR的凝胶电泳图像。[Lane编号1=1kbDNA梯状条带，2=无模板（阴性）对照，3=使用标准方案在微管中从HeLa-CCL2细胞合成的cDNA的PCR产物（阳性对照），4=在3mmDMA上从HeLa-CCL2细胞合成的cDNA的PCR产物，通过“芯片上细胞到cDNA”方法]。(C-D)分别在3mmDMA和PCR板上通过“Cells-to-cDNAonChip”方法从HeLa-CCL2细胞合成的cDNA的qPCR结果。C和D的条形图表示10、100、500和1000个细胞的Ct值，每个重复5次。误差条表示平均值土SEM。根据双尾非配对t检验，*P<0.001，**P<0.01，计算为连续组之间的比较。NS=不显著。在3mmDMA上siGFP转染至HeLa-GFP细胞的评估：E-G）荧光显微镜图像分别显示未转染、乱序siRNA转染和siGFP转染的细胞中的GFP表达（转染48小时后）。比例尺=100μm。H）转染48小时后HeLa-GFP细胞中的平均GFP荧光。数据表示为来自3个单独实验的平均值土SEM。根据双尾非配对t检验，*P<0.001，**P<0.01。I）在3mmDMA上转染48小时后细胞中GFP转录物水平的qPCR;通过“芯片上细胞至cDNA”方法合成cDNA。数据标准化为GAPDH表达，并表示为来自3个单独实验的平均值土SEM。*P<0.001，如通过双尾非配对t检验计算的。
稀有细胞分析：从10个循环肿瘤细胞（CTCs）中成功提取mRNA，检测到EGFRT790M突变，灵敏度较传统方法提升10倍[1]。
无动物源培养：在无Matrigel的DMA表面，hiPSCs培养24小时存活率达70%-76%，Nanog蛋白表达量较传统培养高1.8倍（P<0.05），证明微尺度环境可替代动物基质 [4]。
I.DOT通过纳升级非接触式分配，解决了传统移液的交叉污染与机械损伤问题，单细胞接种误差<5%，单日可处理超1000样本，为稀有样本（如临床活检细胞）的高效利用提供关键工具。从细胞到cDNA的闭环操作减少7次样本转移，使核酸损失降低60%，结合DMA的透明基底特性，实现“形态-基因”双维度数据快速关联[1,2]。
在应用场景与转化潜力方面，液滴平台在肿瘤药敏筛选中可同步分析200种化合物对细胞凋亡（AnnexinV染色）和Bcl-2通路基因表达的影响，将周期从2周压缩至3天；在单细胞医学前沿，可用于胚胎干细胞（ESC）的多能性维持研究，通过I.DOT精准控制Wnt/β-catenin信号分子浓度，使Oct4阳性细胞比例提升至92%±2%[4]；在便携化临床检测方面，结合便携式荧光成像模块，可在床边对肿瘤穿刺样本进行当场基因分型（如肺癌EGFR突变检测），将报告时间从3天缩短至6小时。当前技术面临的挑战是需进一步优化液滴长期培养的营养补给（如动态微流控灌注），并开发AI算法实现“液滴图像-基因数据”的自动化关联分析，未来随着I.DOT与光镊、质谱等技术的融合，DMA平台有望成为单细胞多组学（基因组+蛋白质组）研究的核心工具，推动精准医疗从“群体统计”迈向“单细胞解析”的新维度。
