在肿瘤学领域，单细胞生物学已成为研究细胞异质性和癌症生物学所涉及的细胞信号通路（如免疫耐受）的重要工具。单细胞转录组学尤其被用于了解肿瘤细胞的复杂性以及与疾病进展和治疗反应（包括耐药性）相关的特定生物标记物。然而，单细胞转录组学的质量在很大程度上依赖于细胞分离和样本制备，以保持RNA的质量，并在生成cDNA和制备文库之前去除死细胞和碎片。流式分选可用于收集特定细胞群，并清除死亡或濒死细胞。然而，使用高压液滴形成的传统细胞分选方法会进一步损伤细胞，导致基因表达变化或RNA整体降解。此外，传统高压流式会产生具有生物危害性的气溶胶，存在样本间交叉污染的风险。
WOLF柔性单细胞分选仪是一种低压微流体细胞分选仪（>2 psi），用于温和地分选细胞，不会像传统流式高压喷嘴形成液滴，采用可抛弃式微流控芯片，进一步降低了生物危害，因此样本和鞘液接触到的一切都是无菌、一次性的，不会造成样本间的污染。为了展示这种温和的无菌细胞分选仪如何影响 10x 基因组学工作流程中的单细胞 RNA 转录组学，我们与一家大型癌症中心的学术流式细胞仪核心合作，比较未分选的小鼠前列腺细胞与NanoCellect WOLF细胞分选仪和BectonDickenson FACSAriaTM II分选的细胞的样本。
下图显示了两种分选仪的分选图。100,000个细胞在BD FACSAria II和NanoCellect WOLF上进行分选。然后大约5000个细胞进入10x Chromium Controller。将RNA转化为cDNA，使用Chromium Single Cell 3' v3 Kit生成文库，并使用Illumina进行测序。所有样本都用10x Genomics Cell Ranger Pipeline进行分析以检测测序结果的质量。在不同的日期进行了三次独立实验（每次实验3-5只小鼠）。BD FACSAria II和NanoCellect WOLF样品在同一天进行平行分选和测序处理。BD FACSAria II分选两个样本，因为一个BD FACSAria II分选样本产生的结果不具可比性。
在所有三种条件下，10x Genomics Chromium Controller 的细胞均回收5,000个细胞：1）未分选样本；2）BD FACSAria II分选样本；3）NanoCellect WOLF分选样本。回收细胞的数量受几个因素的影响：无活力细胞的百分比、细胞聚集以及细胞浓度的高估/低估。总结显示，未分选样本平均回收了3064个细胞，BD FACSAria II分选样本平均回收了4440个细胞，NanoCellect WOLF分选样本平均回收了4955个细胞（下图A）。未分选样本的细胞回收率最低，而WOLF分选样本的细胞回收率最接近目标数量。由于未分选样本中含有可被算作细胞的碎屑和死细胞，这可能导致高估了装载的存活细胞，从而导致未分选样本和BD FACSAria II样本中回收的细胞数量较少。
每个细胞的基因中位数和每个细胞的唯一分子标识符（UMI）中位数都是衡量文库复杂性的指标。WOLF分选样本的每个细胞基因中位数（1,711个）和每个细胞独特分子标识符中位数（4,932个，下图B，C）平均最高。Cell Ranger Summary还显示了与细胞无关的读数比例，这是无细胞污染RNA的指标。在这一指标中，WOLF分选样本与细胞无关的读数百分比最低（10.3%），而未分选样本的百分比最高，这与较高的碎片和死细胞存在率（19.2%）一致（下图D）。这些结果表明，经WOLF分选的样本中来自碎片和死细胞的污染RNA数量最少。
条形码等级图通过显示 1）与细胞相关的条形码；2）来自空分区的条形码之间是否存在明显的分隔，来帮助评估RNA的完整性。与活细胞相关的条形码的UMI计数应大大高于无细胞或低质量细胞的背景条形码。因此，在RNA质量较高的样本中，UMI计数和条形码之间会出现陡峭的斜坡或下降。下图显示了每个样本的UMI与条形码对比图，与未分选的对照样本相比，在BD FACSAria II和WOLF分选样本中可以观察到更陡峭的斜坡或弯头（高亮圆圈）。这些结果表明，在10x Genomics工作流程的上游使用细胞分选仪可提高RNA质量，同时减少来自无细胞来源的污染RNA。WOLF分选样本的UMI计数也更高，反映出细胞分选过程对细胞的损伤更小。
该实验表明，使用BD FACSAria II或WOLF进行样本制备，可减少碎片和死细胞对RNA的影响，从而获得更高质量的scRNA测序结果。此外，这些数据还表明，使用细胞分选仪去除死细胞和碎片可提高细胞计数的准确性。
虽然WOLF和BD FACSAria II分选的样本都能产生较高的文库复杂度和较低的与条形码无关的读数，但WOLF分选的样本显示出最有利的结果，与传统的液滴式细胞分选仪相比，使用简单易用的微流控细胞分选仪进行样本富集的RNA完整性更高。因此，在10x基因组学工作流程中使用温和的细胞分选仪（如WOLF细胞分选仪）进行细胞分选是产生高质量scRNA测序结果的更有利的方法。
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