我们的研究表明，用于细胞系开发的 C.BIRD™ 微生物反应器能够改善 96 孔培养的哺乳动物细胞生长情况，并且在细胞生长曲线和蛋白质产量方面与摇瓶培养数据极为相似。传统的细胞系开发（CLD）流程由于早期和后期开发过程中产生的细胞系特征不一致，需要花费大量时间才能找到最优克隆。C.BIRD 系统是一种新的细胞培养创新技术，通过减少两个阶段之间的细胞特征差异，并在 CLD 流程的早期提供最佳悬浮培养条件，解决了这一问题。在本研究中，我们使用 C.BIRD 系统和不使用 C.BIRD 系统培养中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系，并比较了生成的细胞特征与在摇瓶培养环境中培养的细胞特征之间的差异。结果表明，C.BIRD 提高了活细胞/总细胞生长和细胞活力，并且与大规模摇瓶培养具有出色的可比性。此外，细胞倍增时间和相对蛋白质产量都有显著提高，且在统计学上没有差异。
生物制药行业正在呼吁加快细胞系开发（CLD）流程，以便新生物制品能够更快获得监管部门的批准。然而，传统的 CLD 流程可能需要数月甚至长达一年的时间才能确定最佳的细胞克隆。如此漫长的周期的一个原因是在 CLD 的早期阶段选择合适的克隆时遇到了困难。早期细胞数量较少，采用静态培养。后期则会转变为悬浮培养，以扩大细胞产品的产量。从静态培养到悬浮培养的转变会产生不同的细胞系特征（生长速率、滴度、代谢特征等）。这阻碍了在早期 CLD 过程中正确细胞克隆的识别。因此，需要大量的克隆进行测试，这增加了 CLD 的成本和所需时间。为了加快开发进程，整个过程中保持一致的细胞培养条件至关重要，以便在 CLD 过程中早期识别具有正确且可持续特征的细胞克隆。
高通量技术正越来越多地应用于细胞培养实验（CLD）流程中。这些技术能在小规模的培养皿/试管中提供悬浮培养环境，并增强氧气供应。在本研究中，我们展示了一种新的系统，即 C.BIRD 微生物反应器系统，它能够在标准的 96 孔板中实现早期阶段的悬浮细胞培养。C.BIRD 系统结构紧凑，易于放入标准培养箱中。它有一个对接站，可容纳三套 C.BIRD 系统（图 1A）。该系统由两部分组成：顶部的自主控制箱（图 1B）和带有 96 个圆柱形管的消耗性 C.BIRD 盖子（图 1C）。C.BIRD 盖子上的管子提供了 96/24 个液流通道，使得在标准细胞培养板中的每个孔都能吸入和排出空气。这些通道与气动连接，并由控制系统驱动，从而在 96 孔板中每个孔内实现 150 - 200 µL 工作体积的连续往复混合（图 1D）。有了 C.BIRD，就可以在 96 孔板中实现体积小至 150 - 200 µL 的细胞培养规模的三维悬浮培养环境。C.BIRD 可以模拟振荡器的作用。在良好的细胞培养环境以及从早期阶段就加速细胞系分化（CLD）进程的情况下，从而为细胞更好地生长以及克隆特征的可预测性提供了新的可能性。
本研究使用了表达 CHO-K1 单克隆抗体的细胞系。该细胞系在化学定义且不含动物成分的培养基（GibCo 公司生产的 CD Hybridoma 培养基 #11279-023）中适应悬浮培养。所有实验均使用标准 96 孔板（德国 Eppendorf 公司产品编号 #0030730011）进行。比较研究是在标准静态培养基、30 毫升摇瓶培养基（摇瓶转速：130 转/分钟；轨道半径：19 毫米）以及 37°C、5% CO2 培养箱环境中培养的细胞上进行的。细胞数量和细胞活力通过 Bio-Rad 公司的 TC20 自动细胞计数仪进行计数。在相同条件下不同时间点的细胞计数是在单独的培养孔中进行的，以确保细胞生长不受干扰且计数准确性不受影响。比较细胞生长和蛋白质生成情况。使用 Bethyl Lab 公司的 ELISA 试剂盒（E88-104）进行滴度测量。数据通过非配对 t 检验、单因素方差分析（ANOVA）进行分析。p 值的显著性如下：0.12（无统计学意义，ns），0.033（*），0.002（**），0.0002（***）和 <0.001（****）。数据以均值±标准差的形式呈现。
本实验设计如图 2A 所示。我们从 96 孔板（200 µL）到 30 mL摇瓶考察了 mAb CHO-K1 细胞系在两种不同规模下的每日细胞生长/倍增时间/蛋白质产量，并在 96 孔板中比较了两种不同的培养条件：标准静态培养C.BIRD悬浮培养。我们的结果表明，采用悬浮培养的C.BIRD系统表现出优于静态培养的优越性能，并且与摇瓶培养表现出相似的细胞系特征。
培养细胞 5 天后，C.BIRD 悬浮培养和摇瓶培养分别实现了 4.4×10E6 个细胞/毫升和 4.9×10E6 个细胞/毫升的活细胞密度，而静态培养在第 5 天仅达到 1.2×10E6 个细胞/毫升（图 2B）。细胞密度的 3.5 倍差异表明，与静态培养相比，C.BIRD悬浮培养为细胞生长最大化提供了更理想的生长条件。
同样，每个条件下的总细胞密度也呈现出相同的趋势。96 孔 C.BIRD 培养和摇瓶培养分别实现了每毫升 5.2×10^6 个细胞和 5.7×10^6 个细胞的总细胞密度，而静态培养在第五天仅达到 2.0×10^6 个细胞/毫升（图 2C）。这些数据提供了强有力的证据，表明在 96 孔规模下，C.BIRD 培养提供了最理想的细胞生长条件。对三种培养条件的可行性比较表明C.BIRD 培养法的表现优于静态培养法，其细胞存活率保持较高水平，与摇瓶培养条件相当。C.BIRD 培养法和摇瓶培养法在第 5 天时细胞存活率仍保持较高水平，分别为 84.3% 和 86.3%。然而，静态培养法在第 5 天时细胞存活率降至 60.3%（图 2D）。
且与静态培养相比，C.BIRD 培养法显著缩短了细胞的倍增时间，从 114 小时缩短至 38.5 小时。在摇瓶培养（35.1 小时）和 C.BIRD 培养（38.5 小时）之间，细胞的分裂时间没有显著差异。结果表明，96 孔 C.BIRD 具有高性能水平，并且能够在早期提供摇瓶生长条件（图 2E）。
最后，每种培养条件下的细胞系蛋白质产量呈现出相同的模式。与静态培养相比，C.BIRD 培养下的蛋白质产量的倍数变化显著更高（高 0.7 倍），而 C.BIRD 和摇瓶之间的倍数变化没有显著差异（2.86 倍对 3.21 倍），如图 2F 所示。
该研究表明，C,BIRD在 96 孔培养环境中在三个方面改善了哺乳动物细胞的生长：1）细胞生长，2）倍增时间，3）蛋白质产量。我们还证明C.BIRD系统在细胞生长曲线和蛋白质产量方面与摇瓶培养非常相似。
总之C.BIRD 使细胞能够更早地过渡到悬浮细胞培养，在标准 96 孔板中具有更高的细胞生长率，这有可能为后续的 CLD 过程提供更好的向大规模摇瓶/生物反应器条件的转化。
