目前，电驱动的DNA纳米杆相关技术，被用于检测流感病毒，比如Influenza A/Aichi/2/1968，与其受体蛋白/肽PeB的相互作用。该受体蛋白能够与病毒颗粒表面的血球凝集素蛋白特异性的结合。
该技术被称为switchSENCE，其原理是将DNA链锚定在生物芯片的表面，并将受体肽PeB与DNA链进行耦合，以实现将受体肽固定在芯片表面的目的。同时，其中锚定在芯片表面的单链DNA携带荧光基团，而与其互补的DNA链则根据研究的需要，可以设计携带多价肽等受体分子。形成的双链DNA纳米杆，在芯片电极提供的负电压条件下，可以保持直立的静止状态。信号的检测基于互作事件发生后，对荧光基团周围环境的改变，导致了荧光信号改变的发生。本研究中，病毒颗粒与肽的相互作用信号的产生说明病毒可以直接做为配体，特异性与固定在芯片表面的受体肽结合，且在较长的时间范围内，病毒能够保持正常活性，处于稳定的结合状态。此外，通过该技术，可以比较不同的病毒亚型与同一受体肽的结合性能。总的来说，本研究证实switchSENCE技术可以利用病毒本身做为研究材料，在病毒颗粒原生态的环境下检测受体与病毒表面配体的互作性能。
流行性病毒的爆发，给人类的生命健康带来极大的威胁，比如严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-Cov-2)的发生及流行。带来类似严重后果的还有在1918年爆发的A型流感病毒Spanish flu, 导致了全世界数百万人口的死亡。A型流感病毒属于正黏病毒科，其具有脂质双层膜结构，膜的表面表达三种膜蛋白：血球凝集素蛋白（HA），神经氨酸苷酶（NA）和M2质子通道蛋白。神经氨酸苷酶可以促进病毒颗粒从被感染的细胞释放，并裂解糖苷酶键；HA可以在病毒与细胞融合之前，与细胞表面含有唾液酸（SA）的细胞受体结合。HA为同源三聚体结构，在其蛋白的球形头部结构域携带三个SA结合位点。单价肽与病毒的结合的亲和性在mM级，但HA在病毒表面广泛表达，可与多个SA分子发生互作，表现出更高的结合性能，我们也将其称为avidity。对病毒与其受体结合的affinity与avidity的研究，将可以帮助我们更有效的理解病毒内化和感染的过程。由于其复杂的结合形式，需要新的技术手段对其进行检测分析。例如，表面等离子共振技术（SPR），核磁共振技术，或者电测量等。
本研究中，我们利用switchSENCE技术，对HA和其受体肽的结合动力学进行了检测。该技术是利用电子驱动的DNA纳米杆实现。该DNA纳米杆通过化学作用，与生物芯片进行结合。该技术已经广泛用于蛋白-蛋白，蛋白-核酸适配体以及蛋白-DNA等分子之间的互作分析。而本研究是将该技术第一次用于病毒-肽的互作检测。
switchSENCE技术，不仅可以检测分子互作之间的亲和性（KD），同时可以实时检测结合常数（Kon)和解离常数（Koff)。在药物发现研究领域，这些分子互作参数，对于潜在药物性能的评估至关重要。分子互作的亲和性，可以通过传统的MST，ITC等技术进行检测，但是它们无法测量实时的结合和解离常数，并且需要进行荧光标记，而switchSENCE技术可以在不标记互作分子的情况下，检测其相互作用动力学参数。与其相似的传统技术有表面等离子共振技术（SPR)，两者在测量分子互作方面具有非常多的相似性和优点，比如：（1）不仅可以测量亲和性，同时可以实时检测动力学参数；（2）都不需要进行标记；（3）较低的样本消耗量；（4）数据检测的较高灵敏度；两种技术也有相似的不足之处，比如：（1）都需要将其中一个分子进行固定，固定本身可能会影响分子互作性能的检测；（2）微流控下的物质运动的限制；（3）非特异性结合发生的可能性。不论是SPR还是switchSENCE技术，对数据的解读都非常重要，需要研究人员的经验和对仪器的深入了解，以实现对结果进行科学合理的评估。
和SPR相比，switchSENCE技术具有相应的优势，其中之一是可以控制受体在其表面结合的密度，以减少分子的聚集，并可以按照不同比例分布两种不同的分子。此外，switchSENCE技术由于利用了DNA互补杂交原理，因此可以应用于多种类型的分子互作场景；尤其当待检测的受体分子是DNA为基础的结构，比如DNA-肽纳米结构，更具有操作上的优势。除此之外，switchSENCE技术还能够用于测量蛋白构象变化以及流体动力学半径测量，这些是SPR无法实现的功能。
PeB受体肽起源于单克隆抗体HC19免疫球蛋白可变区域的互补决定区，已经报道，其对HA2, NA3具有中和效应。已经证实，它能够与A型流感病毒株Aichi H3N2的HA蛋白结合，其亲和性在uM级。虽然该亲和性相比单价分子间亲和性已大大提高，对于治疗型抗体的效率来说，仍旧需要进一步优化和提高。
为了实现进一步优化的目的，许多改进的方法尝试多价互作的形式，以增强小分子配体与生物受体复合物的靶向效率。对于流感病毒的HA受体，其唾液酸配体的结合位点为有序排列的三聚体复合物，两个邻近位点之间的距离大约为4.2nm。在一些实验设计中，以DNA或其它核酸为基础的纳米杆，已经做为一种呈递HA结合配体的骨架，应用于研究中。由于该骨架操作的灵活性，可以呈递单价，二价或三价配体，因此提高了分子之间的结合性能；该设计的第二个优势，体现在遵循沃森-克里克的碱基互补配对原则的DNA骨架设计，使得多种类型的分析检测更加的直观化。通过延长非配对的单链序列，使其可以做为简单的模块，与互补配对链共同锚定在分析检测表面。例如，本研究第一次报道了，利用switchSENCE技术对病毒与锚定在芯片表面的DNA-肽的互作动力学进行检测。
互作分析通过以switchSENCE技术为基础的DRX2（Dynamic Biosensors GmbH, Germany）仪器实现。使用的芯片为MPC-48-1-R1-S 或 MPC2-48-2-G1R1-S（Dynamic Biosensors GmbH）。每个微流控芯片由四个独立的液流通道组成，详情见Figure 1a。
Figure 1: 生物芯片结构及DNA纳米杆结构示意图
每一个通道宽1mm, 高60um, 包含六个金属电极，长度为3.34mm, 每个电极直径为120um, 其与电源相连。每一个电极都与DNA纳米杆相连接。单链DNA纳米杆（NL-B48，序列请见Table 1)通过5’端与芯片表面共价结合，在序列3’端携带有用于信号检测的荧光基团。互补配对的DNA链（cNL-B48，序列请见Table 1），可以与待检测的目标分子进行交联。在本研究中，受体肽（SA)与互补配对的DNA链进行交联。通过DNA分子杂交，使得互补配对链DNA-肽与芯片表面的DNA链进行结合，形成双链DNA。该双链DNA可以用于后续的电驱动的互作分子检测。其结构请参见Figure 1。由于电源可以交替产生正/负电压（AC），因此能够使得带有负电荷的双链DNA在芯片表面进行摆动，被称为“dynamic mode”；电源也可以是保持不变的负电压（DC），使得DNA双链保持直立状态，被称为“static mode”。对于动力学模式，AC电压的范围是-0.3V到0.5V，变化频率为10kHz. 在动力学模式下进行测量时，当DNA双链接近金属电极时，由于发生能量转移，荧光信号发生淬灭，当其离开芯片表面时，荧光强度增强，进而产生周期性的荧光信号的改变。改变过程中发生的荧光光子数，通过实时的单光子计数技术（e-TCSPC）进行检测。在结合事件发生后，由于整体纳米杆的流体动力学摩擦系数的增加，造成了DNA纳米杆在该流体系统中运动速率的减慢，速率的变化可以通过实时的荧光变化进行检测。在静止模式下，电压可以保持在固定数值，本研究中为-0.1V，DNA保持在直立静止状态。该状态下，由于结合事件的发生，导致荧光基团周围的生化，物理等环境的改变，荧光基团的信号发生改变，这种改变不受所结合的分子大小的影响，而是受结合位点周围化学环境的影响，因此主要依赖于互作的类型。
Table 1 DNA纳米杆构成序列
DNA按照Table 1中的序列进行合成。cNL-B48和NL-W48-B48-G1购于Dynamic Biosensors GmbH，寡核苷酸p-cNL-B48, n, n*o, 和 o*p* （见Table 1) 购于Biomers.net. p-cNL-B48寡核苷酸链可以部分的与固定在芯片表面的NLB-48核酸链互补。携带有氨基基团的寡核苷酸链（p-cNL-B48, n*o, o*p*）与PeB肽进行交联并进行纯化；随后，携带PeB肽的寡核苷酸链折叠成四臂结构，请见Figure 2。在进行动力学检测之前，肽与寡核苷酸的耦合效率可以通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行质量评估。该递呈肽的DNA结构，在未与肽结合时分子量为43kDa，与三肽结合后的分子量为49kDa.
Figure 2 寡核苷酸-三肽偶合结构
分子互作检测通过DRX2仪器（Dynamic Biosensors GmbH, Martinsried, Germany）进行。在本测量中，使用的生物芯片序列号为MPC-48-1-R1-S 或MPC2-48-2-G1R1-S（Dynamic Biosensors GmbH）。测量实验流程通过switchBUILD软件实现，并通过switchCONTROL软件逐步实行（软件由Dynamic Biosensors GmbH提供）。芯片上每一个微流控通道在正式检测前，需要使用含有硫醇基的钝化溶液进行处理，然后进行芯片质量检测，以保证芯片在良好的状态下检测到最大强度的荧光信号。DNA链以500nM的浓度与芯片进行杂交，杂交时间为320s，该互作动力学检测在静止模式下进行。底物的分析浓度范围为10-40ug/ml。对于结合过程，底物上样体积为50ul，流速为1ul/min，结合时间为50min; 对于解离过程，流速为3ul/min，解离时间为13.3分钟。
在三明治模式的动力学检测中，使用的是NL-W48-B48-G1寡核苷酸链，其部分与cNL-B48互补。该寡核苷酸链携带有绿色荧光基团。在检测之前，DNA链（NL-W48-B48-G1 和DNA 纳米结构ss1/2/3PeB）进行杂交，使得DNA纳米结构标记上绿色荧光，用于后续检测。两条互补寡核苷酸链以1:1的比例混合，避光室温孵育1小时。三明治检测模式是以ss2PeB做为配体，将病毒X31进行捕获，然后以肽-DNA 结构ss1/2/3PeB-NL-W48-B48-G1做为底物进行上样分析其与病毒结合的动力学。该测量在swithcSENCE静止模式下进行。
相互作用检测的基础为与芯片耦合的携带荧光基团的DNA寡核苷酸链（NL-B48）以及与其互补配对的携带有受体肽的寡核苷酸链。病毒颗粒在该检测中，做为底物进行上样分析。DNA之间杂交形成纳米结构是在动力学模式（dynamic mode）下进行（请见Figure 3)，病毒颗粒的结合是在静止模式下进行（static mode)。荧光基团信号的变化，表征结合事件的发生。DNA链杂交后，检测将转为静止模式，DNA-肽结构处于直立静止状态。本检测中，互补配对的第二条DNA寡核苷酸链具有四个核苷酸臂，其中之一部分与固定在芯片上的NL-B48单核苷酸链进行互补，其余三条臂分别携带一个肽分子PeB。在具体实验中，可灵活设计携带有单个，二个，三个或不携带肽分子的DNA结构。Figure 3b表示的是cNLB48以及ss3PeB和固定在芯片上的NLB-48杂交的示意图。杂交的过程，提供的是交替变换的电压，在互补配对链结合之前，单链DNA的运动是比较微弱的，可能由于单链结构的灵活性，使得荧光基团与芯片表面的距离比较接近，荧光信号变化幅度较低。一旦与互补链配对，请见Figure 3, 双链DNA的移动幅度大大增加，荧光信号变化的幅度随之提升。从Figure 3可以得知，相比于未携带肽分子的互补配对链, ss3PeB与NL-B48杂交的效率更高，这可能是由于大分子扩散速率慢，且DNA双链更长，携带更多的负电荷。
Figure 3 芯片杂交信号检测
芯片杂交完成后，病毒颗粒做为底物进行上样，与肽分子进行结合。请见Figure 4。数据以ss2PeB与病毒的结合进行展示。在结合过程中，保持1ul/min的低液流速率，以保证反应不受快速扩散的影响。因为DNA纳米杆的长度大约为20nm，圆形病毒颗粒的平均直径大约为120nm，杆状病毒颗粒的长度约为300nm。因此单个病毒可能与一个以上的DNA纳米杆单位进行结合。
Figure 4 病毒颗粒与ss2PeB结合示意图
Figure 5展示了不同浓度的X31病毒颗粒和ss2PeB结合的动力学。X31病毒颗粒经液流注入系统后，即可观察到浓度依赖的荧光信号减少的发生。在每一次测量后，芯片都需要再生，然后重新进行DNA链的杂交。经实验观察发现，在极限的750s解离时间内，病毒颗粒仍旧稳定的结合在DNA纳米杆结构上。从已有的报道可知，病毒蛋白与其受体结合的亲和性在uM级，这与该实验中观测到的解离结果不符。这可能是由于在该研究中，病毒颗粒与受体的结合是多价模式，导致了结合的avidity效应的发生，结合更加的稳定。因此，这种方法使得对真实的亲和性的检测受到限制。做为阴性对照，ss0PeB(DNA链未与肽分子偶联）用于检测病毒颗粒的非特异性结合。结果表明，病毒颗粒与肽的结合是特异性的。
Figure 5 X31病毒颗粒与ss2PeB结合动力学
该实验设计是将病毒颗粒做为生物材料，固定在芯片表面，目的是为了检测到受体肽与其结合的解离常数及亲和性。在本研究中，ss2PeB与芯片进行杂交，形成双链DNA纳米杆，经由DNA链被标记成红色荧光；随后，X31病毒颗粒被ss2PeB捕获。在上述实验中发现，在整个过程中，病毒颗粒与肽的结合非常牢固，无解离的发生，因此可将该病毒颗粒做为固定的配体，进行后续的二次动力学结合检测。可将标记绿色荧光基团的肽-DNA链做为分析底物，与固定结合的病毒进行结合。
Figure 6展示了该实验设计的原理图。ss2PeB-G1与X31的结合，导致了绿色荧光通道信号的逐步增强。对于结合的起始点，该模式中也有了明显的信号改变。总的来说，无论是结合还是解离，该模式下的荧光信号改变都非常明显，能够让研究人员更加准确的判断结合的起始和解离的过程。通过该三明治模式，可以对肽与病毒结合的解离动力学进行研究。在本研究中，经测量，两者的结合常数为 kon = (1.8 ± 0.8) × 10 5 M −1 s−1 ，解离常数为 koff = (2.3 ± 0.2) × 10 −3 s−1，亲和性为KD = (12 ± 7) nM。未捕获病毒的DNA纳米杆做为对照，用以排除非特异性结合。除了ss2PeB，单价肽ss1PeB-G1和三价肽ss3PeB-G1也进行了相应的检测，三种复合物得到了较为相似的结合和解离动力学常数。ss1PeB-G1, KD = (12 ± 9) nM ，ss3PeB-G1, KD=(8 ± 7) nM.
Figure 6 三明治模式检测病毒与肽结合的动力学
本研究证实了DNA纳米结构可以用于病毒-肽的互作动力学分析。利用switchSENCE技术，将PeB与DNA单链进行耦合，并与A型流感病毒X31进行结合，该结合信号随病毒浓度的变化而变化。但由于两者结合中的多价效应存在，无法通过该模式对解离动力学进行检测。在三明治设计模型中，我们可以实现同时对结合和解离动力学进行分析，进而得到两者互作的亲和性。在这种模式下，两者之间的多价效应对动力学检测的影响较小。后续对于该技术更深入的探索研究，可以对DNA纳米骨架进行优化（比如单臂的长度，中心结点的灵活度等），以最大程度的减小单价递呈模块对结合动力学的影响。目前，由于测量误差太大还不能够区分单价结合的亲和性常数，需要更长的解离时间以达到检测的目的。总的来说，进行病毒-肽之间的互作动力学分析，在传统的SPR技术中遇到了一定的阻碍。由于病毒颗粒结构和蛋白表达的丰度，需要考虑受体的密度，物质的流动速率以及样本制备等方面。在switchSENCE技术中，受体的密度可以通过单链DNA纳米杆的数量进行控制。实验后芯片再生的过程，也会影响到受体的密度，减少了芯片上高质量纳米杆的数量，这是在实验的重复性验证方面需要进行考虑的问题；对于物质转运的限制，可以通过减少芯片上受体的数量以及增加流速解决。然而，芯片上受体数量的减少的同时，还需要考虑仪器整体的信噪比。对于多价结合的动力学曲线，单指数模型无法准确的拟合，需要更多的拟合模型应对复杂的互作动力学结果。总的来说，switchSENCE技术可以广泛的应用到肽的优化，病毒与不同受体，包括核酸适配体，肽，抗体或者蛋白等分子结合的定量和定性分析，并且该技术可以更方便的用于单价和多价结合动力学分析。
