随着能够解析单细胞信息的微流控和基因检测工具的日益普及，对生物学的认识也在不断深入。更重要的是，实现单细胞RNA测序的能力可以对单个细胞进行转录组分析，并以高生物分辨率提供有关流行性、异质性和基因表达的信息。然而，大多数实验室缺乏将单细胞正确分选到96孔板或384孔板的工具，也没有能力制定复杂的RNA-Seq方案。通过将WOLF细胞分选仪（NanoCellect）和QIAseq UPX 3' RNAseq试剂盒（QIAGEN）这两种技术结合起来，我们制定了一套完整的工作流程解决方案，相较于传统方法更加简便，提高了单细胞RNA-Seq检测能力和实验灵活性。
在此，我们将概述完整的工作流程：从细胞检测、单细胞分选到使用QIAseq UPX试剂盒进行单细胞RNA-Seq实验设计。此外，我们还举例说明了典型的数据分析工作流程：从处理FCS流式数据到使用GeneGlobe NGS分析中心的集成云进行RNASeq数据分析。
传统的细胞分拣机使用高压气溶胶-电场偏转技术，而WOLF则不同，它使用微流控细胞分选技术，在小于2 psi的压力下温和地分拣细胞。WOLF使用蠕动泵和低压压电硒鼓，将细胞准确地分拣到2个不同的腔室（下图A）。微流控是一次性无菌使用的，与细胞培养基等特定应用缓冲液兼容。这样就不会发生样品交叉污染，样品接触到的所有东西都是完全一次性的（下图B）。此外，WOLF和N1单细胞分装机的体积不到2立方英尺，可以直接放置在生物安全柜中，实现完全无菌的环境，降低污染风险（下图C）。此外，WOLF还支持富集分选和单细胞分选两种模式（下图D）。
N1可将1至100个细胞直接分装到96或384孔板中。此外，与细胞打印机和有限稀释法相比，WOLF和N1有5个检测参数，可提供更高的单细胞检测率和活死细胞分辨率。为了证明WOLF从死亡细胞和碎片中分选出有活力细胞的能力，将热处理（死亡）的CHO细胞和健康的CHO细胞按50:50的比例混合，分选后分配到96孔板中。混合细胞用碘化丙啶染色，以标记死细胞。然后用WOLF从样品中分辨出死细胞（下图A）。分析结果显示，60%的细胞为死细胞。分选后的分析表明，WOLF能够将死细胞/碎片减少到只有6%（下图B）。然后根据PI阴性/存活细胞门将健康的CHO细胞分选到96孔细胞培养板中（下图B）。使用Synentec NyOne成像仪分析单细胞喷点效率（下图C）。共分析了9个板。结果显示，WOLF-N1在96孔板上的单细胞喷点效率平均为85%。这些结果与分选对照相似（下图D），表明WOLF-N1平台能够温和地分选细胞，而不会造成细胞死亡。
WOLF-N1平台除了能在孔板上分选外，还能直接在PCR板上分选，WOLFviewer软件能检测分装的单细胞的荧光强度（下图A、B）。为了确定和比较N1的分拣效率，将beads分配到8个96孔培养板（对照）和13个96孔PCR板中。细胞培养板和PCR板的分选效率差异不大（下图C）。细胞培养板的平均置板率为98%，而PCR板的平均置板率为90%。此外，单细胞置板率是根据每孔检测到的基因转录组数量确定的。使用N1分选两板293T细胞，然后使用Qiagen UPX 3'转录组试剂盒完成文库制备。每孔估计细胞数定义为：<100个基因= 0个细胞，100-1499个基因=每孔1个细胞，1500个以上基因=每孔2个或更多细胞。我们估计，在96孔板中，1号板72%的孔有1个细胞，2号板92%孔有1个细胞（下图B）。这些结果表明，N1能够成功地将单个细胞培养到PCR板中，并产生单细胞RNA测序结果。
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