基于DNA的大小和形状可调控的膜纳米孔

在生物学，便携式DNA测序，无标记单分子分析和纳米医学方面，膜纳米孔都体现了其重要的应用价值。传统的物质运输，其依赖于膜上数纳米宽的桶状通道，但是科技发展的需求，需要在形状上可调控的，更加宽的纳米通道，以适应更广泛的应用。而在天然状态下，并不存在这种类的纳米孔。利用蛋白合成该类型的纳米通道，也具有极大的挑战性。本文介绍了利用DNA进行上述结构可调和功能应用多样化的膜纳米孔的设计。该设计将成束的DNA双链制备成构成膜孔的亚单位，并逐步组装成形状上可调节的完整性膜孔，该孔的宽度可达几十纳米。用于识别或信号连接的功能单位，可以与该纳米孔进行结合。通过现有仪器设备和检测手段，本文证明了该定制化的纳米孔在电介导的10nm大小的单分子蛋白的检测上应用潜能，并显示了在合成生物学，单分子酶学和生物物理分析以及便携式诊断，环境检测等方面，该DNA纳米结构如何实现对功能性分子的传递作用。

膜纳米孔的的腔面性质或参数决定了其生物学功能。在纳米孔对物质的感应中，通道的宽度调控着单个分子的进入及通过的过程，并因此影响了由于物质通过引起的电信号。因此，1-5nm宽度的蛋白孔通道能够感应相同大小的DNA链，有机分子和小分子量蛋白。而克服当前由于通道宽度带来的限制，是膜纳米孔研究领域的重大突破。例如，更宽的纳米孔能够在单分子水平上，更快转移，直接的感应及检测分子量更大的酶，免疫球蛋白，蛋白复合物或病毒。并且，在形状上，突破传统的圆柱形通道设计，能够更好的应用于不同形状的底物。并且，该纳米孔应能够连接特异性的分子受体，提高分子识别和结合的特异性。最后，该二代纳米孔，应能够和当前的电信号检测设备兼容，比如用于便携式DNA测序的MinlON，目前为止，该技术还未应用于蛋白分子的检测中。除了分子感应，纳米孔还可以应用于合成的细胞，细胞打孔以用于生物活性物质的转运。目前为止，由于氨基酸较小以及多肽折叠成特定蛋白结构的复杂性，还未有蛋白，肽等构建的符合需求的二代膜纳米孔。由于核酸分子具有简单的碱基互补配对法则和较容易预测的DNA折叠性质，DNA成为了构建该二代纳米孔的可替代材料。确实，已有报道，DNA能够制备成直径达10nm的纳米通道。所有已有的DNA纳米孔均采用DNA双链平行排列的形式插入膜中。

在该文献中，深入详细的阐述了DNA分子如何突破当前的技术限制，增加了纳米孔的尺寸及增加了孔形状的多样性。在最初的DNA纳米孔设计中，我们受限于所有DNA双链需以直角的方式插入膜中的要求。为了克服这种限制，我们利用DNA搭建的方式，将DNA双链成束搭建成纳米孔模块，插入膜中，并组装成完整的纳米孔，请见Fig. 1a-c。模块化的应用能够提高大小和形状上的灵活性，比如可以构建成三角形，方形，五边形和六边形。请见Fig. 1d。结合可调控的边长（10和20nm)的亚单位，构建的纳米孔腔面积可从43nm²到400nm²，请见Fig. 1d。相比于传统的蛋白构成的纳米孔，大小提高了260倍。

可调控大小和形状的DNA膜纳米孔示意图

我们设计的纳米孔，带有一个额外的帽结构，该结构决定了整个孔的形状，即帽下插入膜中的桶状结构。同时，该结构还具有以下特性：该帽状结构可通过双链亚单位的数量，调节其高度和宽度；该帽状结构内部，可通过短的单链或双链DNA进行连接；此外，稳定的内部DNA双链可以防止帽的不稳定及形状的变化；在自我稳定的三角形中，内部可以不需要DNA双链连接；确定的帽的几何形状定性了孔的跨膜形状。在我们目前的设计中，膜孔壁由一个双链厚度组成，但更厚的孔壁是完全可以实现的。在胆固醇脂质的作用下，桶状结构插入膜中。该孔状的设计不仅使得该孔插入到脂质双分子层中，并且可以插入到MinlON flow细胞膜中，以用于免疫学相关的蛋白检测。

我们首先设计一系列六边形帽，不带有穿膜的桶状结构，用以检验膜孔的设计。包括10nm亚单位构成的三角形-10nm帽，方形-10nm帽，五边形-10nm帽，六边形-10nm帽；20nm亚单位构成的三角形-20nm帽和方形-20nm帽。请见Fig. 1d和2a。组装路径包括混合DNA骨架的程序性折叠和DNA寡核苷酸链退火形成特定的纳米结构。经此产生的自组装DNA帽成分均一，可经DNA凝胶电泳进行验证是否为均一的单条带。请见Fig. 2a。

帽结构可经凝胶电泳并纯化后，由负染以及电镜进一步确定其结构。与设计的方案一致，帽的结构呈现预期的多边形形状以及亚单位长度，如长度分别是9.62 ± 0.69 nm, 9.86 ± 0.37 nm 和20.17 ± 1.74 nm的三角形-10nm帽，方形-10nm帽和方形-20nm帽。

DNA纳米孔帽结构及孔结构的组装和性质鉴定

在确定帽设计的可行性后，我们测试了带有桶状的穿膜的纳米孔通道是否可以在形状和大小上进行调节。我们测试了三角形-10nm, 方形-10nm和方形-20nm。请见Fig. 2b。对于该结构和膜的相互作用方面，在5x2的双链DNA帽下方携带了几个固醇类生物标签，每个10nm亚单位连接10个标签，每个20nm亚单位连接15个标签。第一步，首先组装不带有标签的孔状结构，自装后产生与预期一致的单条带的DNA以及与预期一致的电镜结构。第二步，膜孔上连接固醇类标签。可通过凝胶电泳条带大小判断标签连接的结果。请见Fig. 2c。

为了验证固醇类标签能够促进纳米孔和脂质膜的结合，通过电镜直接对标有固醇的方形-20nm的纳米孔在小的膜泡上的形状进行结构分析。并用Atto647N-标记的方形-20nm纳米孔和膜的脂质POPC的荧光共定位进一步确认其与膜的结合。请见Fig. 2e。

可通过单通道电流检测的方法，确认DNA纳米孔以确定的，可调控的通道腔的方式插入脂双分子层。当电压施加于膜上时，该技术可记录通过通道的电子流。我们分析了三角形-10nm纳米孔，方形-10nm纳米孔和方形-20nm孔的电子流，其电导率随着纳米孔的大小增加而增加。请见Fig. 3a, b, c. 在1 M KCl, 10 mM HEPES, pH 7.4和+50 mV的跨膜电势的标准条件下，纳米孔的电流未出现变化。此外，更大的纳米孔产生了更高的电导率，平均变化如下：2.10 ± 0.21 nS (n = 19), 4.58 ± 0.27 nS (n = 29) 和8.91 ± 0.33 nS (n = 17; Fig. 3a(iv),b(iv),c(iv))。三角形-10nm的纳米孔与方形-10nm的纳米孔之间电导率的检测值差异是2.2倍，和理论预期的1.8倍差异几乎一致。方形-10nm和方形-20nm纳米孔之间的电导率检测值差异是1.9倍，比预期值2.8倍低。可能是因为来自侧面膜的压力可能影响了插入其中的通道的大小，可通过增加通道的稳定性而减少这种差异。

多边形DNA纳米孔的电导性能检测

我们进一步测试了DNA纳米孔在单分子水平上对无标记的，特异性的IgG抗体进行检测的能力。我们选择方形-10nm的纳米孔，以适配10nm大小的IgG分子。纳米孔连接有生物素标签，用于特异性结合抗生物素抗体。斑点印迹法确认了抗体与生物素标签的特异性结合。在单通道电流记录检测中，标签并未对电导特性产生影响，请见Fig. 4b，然而抗体的添加导致了电流的阻塞，说明存在单个结合事件的发生，请见Fig. 4b。而此单个事件发生的频率和抗体浓度具有良好的线性相关性，可以通过抗体浓度和1/τon的线性关系进行说明，τon代表的是事件发生的间隔时间，请见Fig. 4b。同时，我们由非生物素化的方形-10nm的对照纳米孔以及非特异性抗体对照组可知，上述结合是特异性的。同样，非同源性BSA做为底物时，生物素化的方形-10nm纳米孔未出现电流阻塞效应。

抗体结合的单分子动力学效应可通过纳米孔的电流相对幅度A/I o变化，请见Fig. 4b以及持续时间，τ off 变化进行检测，请见Fig. 4b。并对它们之间相对关系进行分析，请见Fig. 4d。超过95%的结合事件的电流幅度在48.2 ± 7.7% (±s.d., n = 205; Fig. 4d) 。平均的持续时间τoff在0.66 ± 0.02 s。参数τoff 和 τon 分别代表动力学解离和结合常数Koff和Kon，请见Fig. 4c。抗体的解离常数和结合常数分别是1.79 ± 0.05 s −1 和1.89 ± 0.38 × 10 9 M −1 s−1。经由该纳米孔测量得到的参数稍高于经由switchSENSE技术测量值0.056 ± 0.001 s−1 和1.73 ± 0.05 × 10 8 M −1 s −1 。

单分子平衡解离常数Kd=Koff/Kon, 在该纳米孔体系下测量值为9.45 ± 1.92 × 10 −10 M (±s.e.m.)，接近于switchSENSE技术测量值3.25 ± 0.11 × 10 −10 M。说明了经由纳米孔进行分子结合分析的合理性。依赖于电压的电信号记录说明蛋白通过电泳的方式通过纳米孔，而非通过电渗透。仅正电势可以导致抗体结合的电流阻塞和产生由抗体运动引起的更高的能量谱也可以证明这一点，请见Fig. 4e和Fig. 4f。BSA通过非生物素化的DNA纳米孔的过程中，也可以检测到该电泳现象。

最后，我们评估了DNA纳米孔是否可以插入MinION flow 细胞中，并灵敏的感应人SARS-CoV-2抗体。为了更好的与Y型结构的抗体适配，可以选择三角形-20nm的膜纳米孔。请见Fig. 4g。

DNA纳米孔对特异性无标记IgG分子的检测作用

当抗体的受体没有与纳米孔连接时，三角形-20nm纳米孔能够产生稳定的单通道电流，其平均电导率为7.83 ± 0.71 nS (±s.e.m., n = 9)，高出对照的方形-10nm纳米孔1.7倍，与预期的电导率差异一致。三角形-20nm的纳米孔与SARS-CoV-2 刺突蛋白连接后，成为特异性识别SARS-CoV-2抗体的纳米感受器。请见Fig. 4g。刺突蛋白与纳米孔腔的结合是通过不可逆转的金属螯合作用，将分子连接到寡聚核苷酸上。带有刺突蛋白的DNA纳米孔，可以产生稳定的电流输出，平均电导率为1.8 ± 0.2 nS (±s.e.m., n = 23) ，低于未连接刺突蛋白的三角形-20nm纳米孔的电导率。

当加入人的 SARS-CoV-2 抗体后，能够产生纳米孔的电流阻塞效应，请见Fig. 4h，说明抗体与孔内受体发生结合效应。结合效应产生的相对电信号幅值为61.7 ± 6.9% (±STD, n = 357) ，平均结合时间为1.7 ± 8.6 s (±STD, n = 357; Fig. 4i)。该数据表明，三角形的纳米孔形状能够导致更高的电流阻塞。

膜纳米孔在科学研究中已经显示出重要的价值，我们的研究集中于开发在大小和形状上能够更加灵活调控的纳米孔。该研究依赖于DNA纳米技术得以实现。通过目前的常见检测设备，我们通过单分子蛋白通过纳米孔时的参数证实了该膜纳米孔的应用价值。对于传统的以蛋白质为材料构建的纳米孔，由于孔径的限制，无法对10nm大小的底物进行检测。而分子直接进入纳米腔中，能够最大的获取单分子的生物物理性质，酶活性或相互作用特性等方面的信息。根据底物的大小对纳米孔进行定制，可以实现纳米孔和底物的最佳匹配。更大的纳米孔可以用于不规则的几何构建，匹配非对称性的底物分子。总体上看，该人工合成的纳米孔，突破了在天然状态下的膜孔无法实现的功能，帮助转运并快速方便的检测与其相互作用的蛋白分子，显示出重要的市场应用价值。